临床免疫学检测技术
第一讲 免疫浊度技术
一、免疫浊度法基本原理
免疫浊度法是可溶性抗原、抗体在液相中特异结合，产生一定大小的复合物，形成光的折射或吸收，测定这种折射或吸收后的透射光或散射光作为计算单位。
二、免疫比浊法的特点：
1、自动化免疫分析稳定性好，敏感性高(达ng/L)、精确度高（CV<5%)，干扰因素少，结果判断更加客观、准确，也便于进行室内及室间质量控制。
2、自动化免疫分析快速、简便，结果回报时间短，便于及时将各种信息向临床反馈，又可节约大量人力物力，利于大批量样品的处理。
3、自动化免疫分析能更好地避免标本之间的污染及标本对人的污染。
4、自动化免疫分析可利用多道计数器、测光仪，同一份样品同时测定几十种和临床有关的分析项目，血清用量少，具有明显的应用优势。
三、免疫浊度法分类
（一）透射光免疫浊度法
透射光免疫浊度法是个极简便的方法，测定方式是测定入射光因反射、吸收或散射后的衰减，读数以吸收光单位（A）或OD表示，这种A值反映了入射光和透射光的比率。
（二）散射比浊法
    散射比浊法应用越来越多，且有替代其他免疫定量法的趋势。散射比浊的原理是根据雷利(Rayleigh)公式提出的，当复合物较小时（<3*10）呈全透射，透射与散射相当。当复合物大于入射光波的1/20时，形成不对称前向散射，在90o以前的角度测量散射光皆取得最佳效果，散射光的量代表复合物的量。
1、终点散射比浊法
2、速率散射比浊法
      速率法的灵敏度与特异性都优于终点法，前者的灵敏度比后者高出3个数量级之多，但终点法稳定性好。所谓速率，是在某单位时间内形成大于3*10以上的复合物量（不是积累数），当仪器测定到某一时间单位内形成的速率下降时，即出现速率峰，该峰值的高低，即代表抗原的量。
    速率散射比浊法有三大特点：
  1、时间快，一般在30-60s之内就可完成测试；
  2、比较准确，因其测定形成速率，抗原多，
        速率快；
  3、节省试剂。
（三）粒子强化免疫浊度测定法
      粒子强化免疫浊度测定法的基本原理是，选择一种大小适中，均匀一致的胶乳颗粒吸附或交联抗体后，当遇到相应抗原时，则发生聚集，单个胶乳颗粒在入射光波长之内，光线可透过。当两个胶乳颗粒凝聚时，则使透射光减少，这种减少的程度与胶乳凝集成正比，当然也与抗原量成正比。
四、免疫比浊法的临床应用
（一）检测项目
1、免疫功能监测：免疫球蛋白G、A、M，免疫球蛋白轻链κ、λ，补体C3、C4测定。
2、心血管疾病监测:载脂蛋白A、B，脂蛋白(a)，C-反应蛋白等。
3、炎症状况监测:C-反应蛋白，a-酸性糖蛋白，触珠蛋白，铜蓝蛋白等。
4、风湿性疾病检测：ASO、RF、CRP
5、肾脏功能检测：尿微量白蛋白，a-微球蛋白，β-微球蛋白，转铁蛋白，免疫球蛋白G等。
6、营养状态监测：白蛋白，前白蛋白，转铁蛋白等。
7、凝血及出血性疾病的检测：抗凝血酶Ⅲ，转铁蛋白，触珠蛋白等。
8、血脑屏障监测：脑脊液白蛋白，免疫球蛋白G、A、M。
（二）免疫浊度法测定中应注意的问题
1、伪浊度的影响
           伪浊度形成原因很复杂，主要是抗血清含有非特异性的交*反应性杂抗体成分；增浊剂浓度和反应时间掌握不当；样品本身的浊度处理不当；试剂的污染和变质；器材尤其是比色杯等不够清洁等因素。
2、非特异性散射光的影响
      免疫浊度法经常受内源性光散射的干扰，为避免这些非特异性光散射的影响，应用透射比浊法时需保证抗体组分在3％以下，散射比浊法需保证在 0.5％以下。   
3、钩状效应的影响
      钩状效应存在于各种免疫测定方法中，在免疫浊度测定中也十分明显。现在很多仪器已具有检查钩状效应的功能，一经发现便可对样品稀释后复测。当病人症状与检测结果明显不符时，应怀疑其存在。
[第二讲  固相酶免疫测定技术
一、固相酶免疫测定的原理和类型
（一）ELISA的原理
           基于抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体保持其免疫学活性，抗原或抗体的酶结合物既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。
      用洗涤的方法使固相载体上形成抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，故可极大地放大反应的结果，从而使测定方法达到很高的敏感度。
      ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有三个必要的试剂：1、固相的抗原或抗体；2、酶标记的抗原或抗体；3、酶反应的底物。根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具体条件，可设计出各种不同类型的检测方法。
（二）ELISA反应的类型：
1、双抗体夹心法                                                                                                                          
    检测抗原最常用的方法，操作步骤如下：
（1）将特异性抗体与固相载体联结，形成固相抗体。洗涤除去未结合抗体及杂质。
（2）加受检标本，与固相抗体接触反应一段时间，让标本中的抗原与固相抗体结合，形成固相抗原抗体复合物。洗涤除去其他未结合物质。
（3）加酶标抗体。固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时，固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。
（4）加底物显色。夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量。
在临床检验中，此法适用于检测各种蛋白质等大分子抗原，例如乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）、甲胎蛋白（AFP）、促绒毛膜性腺激素（HCG）等。双抗体夹心法只适用于二价或二价以上较大分子抗原的检出和定量分析，而不能用于半抗原等小分子的测定。
 2、间接法测抗体
      间接法是检测抗体最常用的方法，其原理为利用酶标记的抗抗体以检测已与固相抗原结合的受检抗体，故称为间接法。操作步骤如下：
(1) 将特异性抗原与固相载体联结，形成固相抗原。洗涤除去未结合的抗原及杂质。
(2) 加稀释的受检血清。血清中的特异性抗体与固相抗原结合，形成固相抗原抗体复合物，经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体。其他免疫球蛋白及血清中的杂质由于不能与固相抗原结合，在洗涤过程中被洗去。
(3) 加酶标抗免疫球蛋白（酶标抗抗体，一般为酶标抗人IgG )。它与固相复合物中的抗体相结合，从而使该抗体间接地标记上酶。清洗后，固相载体上的酶量与特异性抗体的量相关。
(4) 加底物显色。颜色深度与标本中受检抗体量相关。本法主要用于对病原体抗体的检测而进行传染病的诊断。本法的主要缺点为受检标本须经稀释（1:50-1:20）的后才能进行测定，否则血清中高浓度的非特异性IgG和其他干扰物质会引起阴性本底过高，影响结果的判断。
3、双抗原夹心法
           反应模式与双抗体夹心法类似。用特异性抗原进行包被和制备酶结合物，以检测相应的抗体。同属抗体检测，与间接法不同之处为以酶标抗原代替酶标抗抗体。在间接法不适用时（例如包被抗原中的杂质可与酶标记的抗入IgG反应），可试用此法。此法中受检标本不需稀释，可直接用于测定，因此其敏感度相对高于间接法。在临床检验中，抗HBs的ELISA常采用本法。
4、竞争法测抗体
      当相应抗原材料中含有与抗入IgG反应的物质，而且不易得到足够的纯化抗原进行包被时，可用此法检测特异性抗体．其原理为标本中的抗体和一定量的酶标抗体竞争与固相抗原结合。标本中抗体量愈多，结合在固相上的酶标抗体愈少。因此阳性反应呈色较浅于阴性反应。由于抗原的难得，在包被时多采用捕获法，即先包被与抗原相应的抗体，然后加入抗原，形成固相抗原。
5、竞争法测抗原
      小分子抗原和半抗原因缺乏可作夹心的二个或二个以上的位点，因此不能用双抗体夹心法进行测定。竞争法的原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合。标本中抗原量愈多，结合在固相上的酶标抗原愈少。因此标本中抗原含量较多的，反应呈色较含量少的为淡。小分子激素，药物等的 ELISA测定多用此法。 6、捕获法测IgM抗体
       IgM抗体的检测用于传染病的早期诊断中。间接ELISA一般仅适用于检测IgG抗体。如用酶标记的抗人IgM作为二抗进行间接ELISA测定IgM抗体，标本中同时存在的不同浓度的IgG抗体将与IgM抗体竞争，而使结合在固相抗原上的IGM抗体相应减少。另外标本中如含有类风湿因子、也会产生干扰。因此用一般的间接法测定IgM抗体不能得到准确的结果。
在捕获法中，用抗人IgM抗体包被固相，以捕获血清标本中的IgM（其中包括针对抗原的特异性IgM抗体和非特异性IgM）。然后加入抗原，此抗原仅与特异性IgM相结合。继加酶标记针对抗原的特异性抗体，再与底物作用，呈色即与标本中的特异性IgM成正相关。此法常用于病毒性感染的早期诊断。 
二、酶免疫测定的发展和应用
（一）ABC-ELISA
ABC为亲和素(avidin)、生物素（biotin）、复合物（complex）的略语。亲和素是一种糖蛋白，可以和4个生物素分子紧密结合。可与蛋白质、糖类和酶等多种类型的大小分子形成生物素化的产物。生物素与亲和素的结合，虽非属免疫反应，但特异性强，亲和力大，二者一经结合就极为稳定。
由于一个亲和素分子有四个生物素分子的结合位置，可以连接更多的生物素化的酶分子，形成一种类似晶格的复合体。因此如把生物素亲和素系统与ELISA偶联起来，就可大大提高ELISA的灵敏度。
ABC-ELISA可分为酶标记亲和素-生物素（labeled avidinbiotin,LAB）法和桥连亲和素-生物素（bridge avidin biotin, BRAB）法二种。前者将酶标记在亲和素分子上；后者通过BNHS分别制成酶-生物素和抗体-生物素，通过亲和素搭桥将二者结合起来。利用生物素-亲和素系统对荧光免疫技术的敏感度也有明显的放大作用。ABC- ELISA已广泛用于细菌、病毒、寄生虫感染等的诊断中。
（二）酶联免疫电转移印斑法
Burnette于1981年建立酶联免疫电转移印斑法（enzyme linked immunolectrotransfer blot, EITB），并称之为西部印斑(Western blot). EITB分三个阶段进行。
第一阶段为SDS-聚丙烯酞胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。抗原等蛋白样品经SDS处理后带阴电荷，在聚丙烯酞胺凝胶中从阴极向阳极泳动，分子量越小，泳动速度越快。此阶段分离效果肉眼不可见（只有在染色后才显出电泳区带）．
     第二阶段为电转移。将在凝胶中已经分离的条带转移至硝酸纤维素膜上。选用低电压（100V）大电流（(1-2A)，通电45分钟转移即可完成。此阶段分离的蛋白质条带肉眼仍不可见。
    第三阶段为酶免疫定位。将印有蛋白质条带的硝酸纤维素膜（相当于包被了抗原的固相载体）依次与特异抗体和酶标记第二抗体作用后，加入能形成不溶性显色物的酶反应底物，使区带染色。阳性反应的条带清晰可辨，并可根据SDS- PAGE时加入的分子量标准，确定各组分的分子量。本法综合了SDS-PAGE的高分辨力和ELISA法的高特异性和敏感性，是一个有效的分析手段，在蛋白质化学中应用广泛。EITB不仅用于分析抗原组分及其免疫活性，并可用于疾病的诊断。
（三）斑点-ELISA
     斑点-ELISA (dot - ELISA)的特点是：1以吸附蛋白质能力很强的硝酸纤维素膜为固相载体；2底物经酶反应后形成有色沉淀，使固相膜染色。在实验室中斑点-ELISA可按下法进行。在硝酸纤维素膜上打成4*4mm的小格。在每格的中央，加抗原1-2ul，成为一个小点。干燥后将每格剪下分别放人ELISA板孔内，按ELISA方法操作，最后加入能形成不溶性有色沉淀的底物，如在膜上出现染色斑点，即为阳性反应。
（四）酶免疫电泳
     常规电泳结合酶免疫反应，可起到微量抗原定位作用。如在甲胎蛋白检测中，将待测血清在醋酸纤维素膜上进行电泳，因甲胎蛋白含量少，位置邻近白蛋白，用一般染色法难于判定。如将电泳后的醋酸纤维素膜与HRP标记的特异性抗甲胎蛋白抗体共同温育，洗涤后加入底物，在甲胎蛋白处即出现显色条带。
电泳结合酶免疫反应的另一种方法，为酶标记抗原对流免疫电泳，用于检测血清中的抗体。方法为将可溶性抗原用酶标记，然后将此酶标抗原与受检血清按常规方法进行对流免疫电泳，最后以底物进行显色，抗原与抗体孔间呈明显的着色沉淀线即为阳性反应，表示有特异性抗体存在。常规对流电泳法中不可见的沉淀带，经酶免疫着色后有时清晰可辨，从而提高阳性检出率。
二、检验项目
酶免疫测定具有高度的特异性和敏感性，几乎所有的可溶性抗原-抗体系统均可用以检测。它的最小可测值可达ng甚至pg水平。与放射免疫测定相比，酶免疫测定的优点是标记试剂比较稳定，且无放射性的危害。
     酶免疫测定商品试剂检测项目最多的为ELISA，可分以下各类：
  1、病原体及其抗体的检测病毒感染如肝炎病毒，巨细胞病毒，风疹病毒，疱疹病毒，轮状病毒，艾滋病病毒（HIV）等。细菌感染如链球菌，布氏杆菌等。寄生虫感染如阿米巴、弓形虫、锥虫等。
  2、蛋白质如各种免疫球蛋白，肿瘤标志物如甲胎蛋白、癌胚抗原、前列腺碱性磷酸酶，激素如hCG, FSH, TSH, hGH, 酶如肌酸激酶-MB，其他蛋白质如铁蛋白等。
  3、非肽类激素如T3, T4，雌二醇，皮质醇等。
  4、药物治疗心脏病药物如地高辛，抗哮喘药物如茶碱，抗生素如庆大霉素等。
第三讲   免疫荧光标记技术
一、免疫荧光技术基本原理
      免疫荧光技术的原理是利用物质吸收光能后，产生激发态而发光的特性。将具有这种特性的荧光素（异硫氰荧光黄或罗丹明B200)用化学方法结合在特异的抗体或抗原上，又不损害其抗体或抗原活性的一种荧光显微镜下的示踪技术。抗体与抗原的结合是高度特异的，所以只要知道其中的一种因子，也就知道了另一种因子。
      免疫荧光技术就是利用上述两种特性，把不可见的抗原抗体的反应（一抗）与被荧光素标记的抗体（抗抗体）反应，变为肉眼可见的荧光，在荧光显微镜下我们所能见到的亮绿荧光，不是标本本身发出的，而是荧光物质受到激发后而发出的亮绿色荧光。
二、免疫荧光技术特点
1、特异的抗原抗体反应，并与形态学相结合，增加试验的特异性和敏感性。
2、利用了物理、化学、组织学、细胞学、生物学等综合性技术，使免疫荧光技术成为一种独立完整的一门方法学。
3、一种荧光抗体可以检查多种抗原抗体复合物。
4、只要知道一种抗体或抗原，就可以知道其对应的抗原或抗体。
 三、免疫荧光抗体技术基本类型
1、直接法：只有抗原、抗体两个因子直接参与反应，利用荧光标记的特异性抗体与相应的抗原结合，以此来鉴定未知抗原，此方法优点是简单快速，特异性高，非特异性反应少。缺点是一种荧光标记抗体只能针对一种抗原，敏感性较差和不能检查未知抗体。
2、间接法：此法是利用荧光标记抗免疫球蛋白
      抗体（抗抗体），鉴定未知抗原或抗体。
第一步： 
      用已知抗体、抗原与未知抗原或抗体反应，这步反应是不可见的，反映的沉淀物被固定在组织、细胞上。第二步：
    加上荧光标记抗免疫球蛋白的抗体，前抗原抗体沉淀物成为相对抗原和荧光标记抗球蛋白的反应，形成抗原抗体复合物，在根据组织或细胞的发荧光部位来判断。此方法优点是，只要一种标记抗体，能与所有免疫球蛋白对应的未知抗原或抗体反应，敏感性高，缺点是如果抗原或抗体纯度不高，实验可受非特异性荧光干扰。 
3、补体法：利用荧光标记抗补体抗体，以鉴定未知抗原或抗体，是补体结合反应的原理。第一步，已知抗体或抗原和未知抗体或抗原反应，第二步，加新鲜补体或新鲜正常人血清反应，第三步，加荧光标记抗补体抗体，则荧光标记抗补体抗体特异的和固定的补体结合。此方法的优点是，只需要一种荧光标记抗补体抗体，就可以检查所有种系的抗原抗体系统。因为补体可被任何哺乳类的抗体抗原系统所固定，并与间接法有同样的优点。缺点是补体不稳定，荧光标记抗补体抗体不能与之固定的补体结合，使试验失败，其次是非特异性荧光强。
四、免疫荧光技术的发展与临床应用
荧光抗体技术已广泛应用于医学和生物学的很多方面，在临床免疫学中主要用于：
1、在细菌诊断中的应用：主要用于鉴定细菌和对抗原结构的研究。如对甲型链球菌的快速诊断和分型鉴定，脑膜炎双球菌的快速诊断等。
2、在寄生虫学诊断中的应用：对于疟原虫、阿米巴、利什曼、纤毛虫、滴虫、钩虫、绦虫、蠕虫等均有不少研究。特别是血吸虫及疟原虫的诊断效果是肯定的。可用已知的寄生虫抗原，检查血清中的抗体，用于寄生虫病的诊断和流行病学调查。也可用于寄生虫感染的免疫学和发病机理等方面的研究。
3、在病毒学诊断中的应用：免疫荧光技术在病毒领域应用最广泛，并且取得很大成就，主要用于病毒抗原在器官细胞内的定位工作，如HBsAg研究就是一例。也用于病毒感染过程的研究，肿瘤病毒的研究和快速诊断的研究。在快速诊断中对流感病毒的快速检出，对乙脑、狂犬病、脊髓灰白质炎、恙虫病等都取得良好的效果；也可用来检查血清中的抗病毒抗体。
4、在免疫病理方面的应用：利用示踪法检查球蛋白的沉积工作已逐渐开展起来，如天庖疮在真皮层基底膜，结节性红斑的沉着在真皮下的纤维层。特别是对于复合物病如：肾小球肾火、类风湿性关节炎、红斑狼疮等利用补体荧光法测定复合物沉着的位置，以了解病变侵犯部位和病变基础。
5、血液中B及T细胞的鉴定。
6、激素和酶的局部组织定位。
7、一些器官移植抗原鉴定。
8、组织中免疫球蛋及补体组分的检测。
9、在诊断自身免疫病方面的应用：
(1)抗核抗体（ANA)：是自身免疫性疾病最常出现的一种抗体，特别是系统性红斑狼疮，阳性率更高，因此常作为辅助诊断之一，其它如类风湿性关节炎、硬皮病、慢性肝炎等血中亦可出现较高效价的抗体。目前，已将此试验作为许多自身免疫病诊断的重要参考。
（2）抗线粒体抗体：在慢性活动性肝炎患者中，如抗体效价在1：256以上可以认为是自身免疫性肝炎。原发性胆汁性肝硬化约有98％出现线粒体抗体，慢性活动性肝炎在31％左右。线粒体抗体在胶原性疾病中可见（2-8％）且效价远较自身免疫性肝炎低。
（3）抗平滑肌抗体：这是对平滑肌组织的特异性抗体，没有器官和种属特异性。其临床意义对于自身免疫性肝炎约82％，急性肝炎早期也可出现抗平滑肌抗体，有人报告早于HBsAg出现。
（4）甲状腺球蛋白的抗体：甲状腺球蛋白是甲状腺腺泡内主要激素贮存形式，形成胶质蛋白。患甲状腺炎时，有大量甲状腺球蛋白从受损的腺泡中外渗，而形成自身抗原，从而刺激机体产生自身抗体。
（5）抗胃壁细胞抗体：具有器官特异性，主要见于恶性贫血和低色素性贫血病人。
（6）其他自身抗体：如抗肾小球基底膜抗体，诊断肾小球肾炎。抗横纹肌抗体可用于诊断重症肌无力，抗肾上腺抗体诊断阿狄森氏病。
第四讲   流式细胞术
一、流式细胞术简介
    流式细胞术（Flow Cytometry FCM）是一种对单细胞或其他生物粒子膜表面以及内部的化学成分进行定量分析和分选的检测手段，它可以高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数，同传统的荧光镜检查相比，具有速度快，精度高准确性好等特点，成为当代最先进的细胞定量分析技术。自20世纪70年代以来，随着流式细胞技术水平的不断提高，其应用范围也日益广泛。目前，流式细胞已普遍应用于免疫学、血液学、细胞生物学、细胞遗传学、生物化学及肿瘤学等临床医学和基础医学领域。
    流式细胞仪集电子技术，计算机技术、流体理论于一体，是一种非常先进的检测仪器。流式细胞仪的发展始于1953年，Parker和Horst设计一种全血细胞计数器装置，该仪器成为流式细胞仪的雏形。其原理是先将全血细胞进行染色，白细胞染为蓝色，红细胞仍为红色，当细胞悬液通过检测细玻璃管时用一束光进行照射，不同细胞所发出的蓝光或红光经过滤光片后分别由两个光电转换器转换为电信号，再由计数电路分别计数。
二、流式细胞仪的组成及工作原理
（一）流式细胞仪由五部分组成：1、流动室及液流驱动系统。2、激光光源及光束成形系统。3、光学系统。4、信号检测与存贮、显示、分析系统。5、细胞分选系统。
（二）FCM基本原理
    将待测细胞染色后制成单细胞悬液。用一定压力将待测样品压入流动室，不含细胞的磷酸缓中液在高压下从鞘液管喷出，鞘液管入口方向与待测样品流成一定角度，这样，鞘液就能够绕着样品高速流动，组成一个圆形的流束，待测细胞在鞘液的包被下单行排列，依次通过检测区域。流式细胞仪通常以激光作为激发光源。经过聚焦整形后的光束，垂直照射在样品流上，被荧光染色的细胞在激光束的照射下产生散射光和激发荧光。
这两种信号同时被前向光电二极管和90度方向的光电倍增管（PMT）接收，光散射信号在前向角度10.5-2.0度进行检测，这种信号基本上反映了细胞体积大小；荧光信号的接收方向与激光束垂直，经过一系列双色性反射镜和带通滤光片的分离，形成多个不同波长的荧光信号。这些荧光信号的强度代表了所测细胞膜表面抗原的强度或其核内物质的浓度，经光电倍增管接收后可转换为电信号，再通过模／数转换器，将连续的电信号转换为可被计算机识别的数字信号。
    计算机采集所测量得到的各种信号进行计算处理，将分析结果显示在计算机屏幕上，也可以打印出来，还可以数据文件的形式存贮在硬盘上以备日后的查询或进一步分析。细胞的分选是通过分离含有单细胞的液滴而实现的。在流动室的喷口上配有一个超高频的压电晶体，充电后振动，使喷出的液流断裂为均匀的液滴，待测细胞就分散在这些液滴之中。将这些液滴以正负不同的电荷，当液滴流经带有几千伏的偏转板时，在高压电场的作用下偏转，落入各自的收集容器中，不予充电的液滴落入中间的废液容器，从而实现细胞的分离。 
三、流式细胞仪的临床应用
（一）FCM在免疫学中的应用
1、外周血T淋巴细胞亚群的测定
正常机体中各淋巴细胞亚群相互作用，维持着机体的正常免疫功能。当不同淋巴细胞亚群的数量和功能发生异常时，可导致免疫紊乱并发生一系列的病理变化。
      越来越多的研究表明，T淋巴细胞亚群在某些临床疾病如自身免疫性疾病、免疾缺陷性疾病、变态反应性疾病、病毒感染、恶性肿瘤等均有异常改变。因此，T淋巴细胞亚群的检测对控制这些疾病的发生发展，了解疾病的机制、指导临床治疗都有极其重要的意义。
2、FCM在艾滋病监测中的应用
艾滋病，即获得性免疫缺陷综合征（AIDS），是由于人类免疫缺陷病毒（HIV）侵犯T辅助淋巴细胞（TH）所致。发病后由于病毒在CD4+细胞内繁殖，导致溶解性破坏，致使CD4+细胞数量显著下降，继而累及各免疫功能器官，造成全身免疫功能下降，最终因各种继发性感染和肿瘤而发病死亡。由此可见，CD4+T细胞绝对计数及其在淋巴细胞中的比例对AIDS的检测起着至关重要的作用。
3、细胞内染色和细胞因子的测定
人体内的免疫细胞和某些非免疫细胞具有合成和分泌小分子多肽功能，这些小分子参与调节多种生理功能和细胞功能，统称为细胞因子（cytokine)。对细胞因子的研究，有助于在分子水平阐明免疫调节机制，有助于疾病的预防、诊断和治疗，特别是利用相应的细胞因子，在治疗肿瘤、感染、造血功能障碍、自身免疫疾病等方面已取得令人满意的效果，前景乐观。因此，细胞因子的检测和研究正成为一个热门题目。
（二）流式细胞术在血液病学中的应用
1、白血病免疫分型
白血病免疫分型是利用单克隆性抗体检测白血病细胞表面和胞浆内抗原，分析其表现型，以了解被测白血病细胞所属系列及其分化系列，它是研究白血病分化抗原和诊断白血病的重要手段。
     从多能造血干细胞（PHSC）分化成熟为功能细胞的过程中，细胞表面和细胞浆内抗原随着分化成熟过程不断发生改变，这些抗原称为造血细胞分化抗原。如，髓系细胞的CD33 、CD13 、CD14、CD15等抗原，巨核系的CD41、 CD42、 CD61等抗原，T淋巴细胞的CD2、CD3、CD4、CD5 、CD7、 CD8等抗原，B淋巴细胞的CD19、CD20、CD22等抗原。
2、淋巴瘤的免疫分型
通常淋巴瘤细胞表达B细胞（smIg, CD19, CD20, CD5）,T细胞（CD2,CD3,CD5,CD7,CD8,）或T/B细胞表型．这些复杂的表型与细胞形态亚型关系不大，也没有发现一致性的预后意义。它主要用于鉴别诊断，如滤泡性淋巴瘤，主要表达B细胞标志，但不表达CD5，可以区分滤泡性淋巴瘤白血病和慢性淋巴细胞型白血病。
3、白血病微小残留病变和化疗效果的监测
      微小残留病变（MRD）是白血病复发的根源。对MRD的早期监测，可避免复发，延长缓解期。常规检测方法（如形态学检查、组化和血清学检查）难以发现MRD，只能采用免疫表型、细胞遗传学（FISH荧光原位杂交）和PCR等方法进行检测。由于单纯的分子生物学方法检测MRD具有一定的局限性，而FCM可以同时定量测定多个参数，结合分选功能，可以分出感兴趣的细胞，进而研究其它分子生物学特性。所以FCM与分子生物学技术相结合可进一步提高检测水平。
4、骨髓移植和干细胞移植的监测
(1)移植前监测骨髓和外周血造血干细胞为保证移植重建的成功，每千克体重至少需要1.2×106个CD34+细胞，早期造血重建依赖祖细胞，持久的植活依赖干细胞，因此移植中必须有足够数量不同分化阶段的造血干／祖细胞。CD34+细胞是造血干／祖细胞的特异性标志，联合应用其他分化抗原如CD38, CD33, CDw90, HLA - DR等，用免疫双标记或多重标记法通过FCM可以测定出CD34+细胞总数及各分化阶段干／祖细胞数。
(2)移植后监测免疫功能移植后细胞免疫表型的变化有助于推测骨髓重建是否正常进行，骨髓恢复正常则表现为：自然杀伤细胞（NK）增多，并出现少见细胞表型细胞，如NK细胞表达少量CD8、CD5阳性的B细胞，CD4, CD8阴性的T细胞。
5、流式细胞术在免疫血液病中的应用
（1）阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)的临床论断  PNH是一种以补体介导的血管内溶血为特征的造血干细胞克隆性疾病。目前研究证明，PNH患者的血细胞膜上缺乏多种糖化肌醇磷脂结合蛋白（GPI锚蛋白），如C3转换酶衰变加速因子（CD55）、反应性溶血膜的抑制物（CD59）等，致使血细胞对补体异常敏感，出现血管内溶血为特征的一系列症状。
国内大多数医院实验室诊断PNH仍限于溶血实验，此法并非特异性诊断实验，而通过流式细胞仪及免疫荧光技术检测外周血红细胞膜、白细胞膜及网织红细胞膜上CD55和CD59的表达，将是诊断PNH的重要手段。
（2）免疫性血小板疾病和中性粒细胞减少症的临床诊断  原发性血小板减少性紫癜和中粒细胞减少症患者血液中存在着抗血小板抗体和抗白细胞抗体，流式细胞仪可以用于这些抗体的分析。
6、血小板膜表面受体测定在血栓性疾病方面的应用
目前认为，与血小板功能有关的血小板膜受体有Ⅱb、Ⅲa、IIb/Ⅲa复合物、Ⅱb、vWF、 GMP140 、Fg等。其检测方法不尽相同，有SDS-PAGE法、交*免疫电泳法等等，这些方法难于检出含量较低的膜受体。免疫印记法的灵敏度较高，但标本用量大，操作复杂，膜纯化过程中受体变化大、易丢失，因此临床实验室较少应用。
放免法则易受其他细胞的干扰或因一个抗原分子结合多个抗体而测定结果不准确。以FCM测定血小板膜受体，是分析血小板功能方法学上的一大进步，该方法测定准确、快速、特异，操作方便，重复性好，标本用量少，非常适合于临床常规检测。
7、在贫血中的应用
 网织红细胞分析是临床上监测贫血的一个重要指标。人工镜检仍普遍用于网织红细胞计数。但许多研究证明，镜检法计数精确性差，受人为因素干扰大，而且用肉眼无法准确判断网织红细胞的成熟程度（RNA含量），随着流式细胞仪及一系列自动化网织细胞分析的出现，不但能快速、准确地计数网织红细胞（RET％）(1分钟内测定10000个细胞以上)，而且可提供新的评价红细胞生成活性的参数-网织红细胞成熟指数（RMI）。
（三）流式细胞仪在细胞增殖和肿瘤病理研究中的应用
1、细胞周期和DNA倍体分析
   FCM进行DNA分析的原理在生物细胞中，DNA含量是比较恒定的参量，DNA含量随着细胞增殖周期各时相发生变化。Go /G1期细胞的DNA含量为二倍体DNA含量，是较恒定的2C值；S期细胞的DNA含量较二倍体高但低于四倍体，即从2C值～4C值；G2/M期细胞的DNA含量为四倍体含量，是较恒定的4C值。
2、碘化丙啶(PI)的荧光标记法  
     对于标记DNA的荧光探针目前最常用的是PI，PI是属于插入性荧光染料，可选择性地定量嵌入核酸双螺旋的碱基之间，其荧光发射为橙红色，如果使用氩离子激光488nm激发，PI发射光谱波长在610-620nm范围，PI的优点是荧光发射强度大，其CV值较小，PI的最佳浓度为50µg/ml, PI不能通过活细胞膜进入细胞内与核酸结合，因此可以用于鉴别死活细胞。
在染色活细胞时，要采用膜打孔方法，把染料引入细胞内，或将细胞固定。另外，PI可与双链RNA结合，故在染色细胞DNA时首先要用RNA酶处理细胞，以排除RNA对定量DNA含量精度的干扰。
（四）FCM在细胞凋亡研究中的应用
1、DNA含量分析由于凋亡细胞DNA被降解后，小分子DNA可通过细胞膜逃逸于细胞外，另外凋亡小体也可带走部分DNA，造成了凋亡细胞的DNA含量非倍体性下降，由此可导致对DNA染料的着色能力下了，表现在G1期峰前出现亚二倍体峰，称为亚G1期峰（凋亡峰）。
2、细胞膜结构的改变在凋亡细胞的形态学改变中，胞浆膜的改变是最早出现的。凋亡的早期阶段可检测到快速、持续的细胞内钙离子升高，大量的钙离子激活谷氨酰胺转移酶，谷氨酰胺转移酶的活化使胞浆膜磷脂的对称性丧失，导致膜内侧磷脂酰丝胺酸（PS）从细胞膜内层暴露于外层，从而可被PS特异的Annexin-V探针所标记。Annexin-V为35-36KD的钙离子依赖性磷脂复合蛋白，对PS有极强的附着力，并可被FITC、PE、Biotin等荧光物质标记。
此方法简单、可*，由于凋亡时细胞膜的改变大大早于DNA的改变，因此Annexin-V染色是检测早期凋亡细胞的敏感方法。但是该方法无法区分凋亡晚期细胞和坏死细胞，因此必须用活细胞。
3、DNA断裂点标记DNA裂解是细胞凋亡的最后一步，由于核酸内切酶活化，使得核小体内DNA断裂为50-300kb的片断，继而裂解为200bp的DNA碎片。由于碎片的产生暴露出多个3’-OH末端，利用脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT)，能够催化外源性的dUTP或Brd- UTP连接到DNA碎片的3’-OH末端。
以荧光物质标记dUTP或抗BrdUTP单抗，就可以用FCM检测到UTPB或rd-UTP的数量，从而间接检测到凋亡过程中DNA碎片上所带的3’-OH末端。此方法灵敏度高、特异性好，目前已被广泛采用。检测3’-OH末端的同时还可以与PI双染色，进一步检测到细胞DNA含量。
（五）其他应用
1、染色体流式核型分析
用流式细胞仪分析和分选人类染色体是分子生物学和遗传学研究中一个非常有效的方法，通过此法，研究者可进行核型分析和鉴定，分离纯化某号染色体并构建染色体特异性DNA文库，这在遗传病基因定位、基因克隆方面发挥着重要的作用。
传统的核型分析采用分带技术显示出不同染色体的特征信息，然后再显微照相、放大、剪接、组型，这种方法不但费时而且无法排除人为主观因素的干扰。目前仪器自动分型的方法有两种：一是采用图像技术的静态方法；二是采用流式细胞术。后者不但能分析染色体，还能纯化得到克隆实验所要求的染色体，这是其他任何技术都无法完成的。
2、流式染色体分析的临床意义：目前，染色体分析已广泛应用于产前诊断、遗传性疾病、放射性损伤、肿瘤细胞染色体分析等多方面的研究。但传统的染色体显带技术分辨率低，人为因素干扰大，而流式核型分析分辩率高，可以分辨显微镜下观察不到的变异，且每分钟分析的染色体数目远远大于人工显微镜计数。
3、细胞内钙离子（Ca2+）的测定
Ca2+ 作为细胞信使，参与许多的生命过程，测量活细胞内Ca2+ ，在细胞生物学中有广泛的意义。作为Ca2+ 的荧光探针，Fluo-3有着自身的特性，信噪比大，激发波长（506nm）适于流式细胞仪的氩离子激光器在488nm激发，所以越来越多地用于Ca2+ 的检测。
第五讲 胶体金技术
 
胶体金技术是七十年代推出的一门检测技术，广泛应用于生物学和医学等领域，目前已成为一种最常用的快速的检测技术。 

一、基本原理及类型 
该技术以微孔膜作为固相，固相膜有很多孔，像滤纸一样，常用的固相膜为硝酸纤维素膜，液体可以穿过流出，也可以通过毛细管作用在膜上向前移动。利用这两种性能建立了两种不同类型的快速检测方法，前者叫免疫渗滤试验，后者叫免疫层析试验，两者统称为“金标”。
胶体金也称金溶胶，是由金盐被还原成原子金后形成的金颗粒悬液。胶体金具有胶体性质、呈色性及光吸收性。因此肉眼观察结果是最简单、方便的检测方法。
二、免疫渗滤试验(IFA)
1、基本原理：以硝酸纤维素膜为载体，利用微孔滤膜的可滤过性，使抗原抗体反应和洗涤在一特殊的渗滤装置上，以液体渗滤过膜的方式迅速完成。
2、试剂：
    (1)渗滤装置：由塑料小盒，吸水垫和点加了抗原或抗体的硝酸纤维素（NC）膜片三部分组成。塑料小盒可以是多种形状的；盒盖的中央内有一直径约0.4-0.8cm的小圆孔，盒内垫放吸水垫料，NC膜片安放在正对盒盖的圆孔下，紧密关闭盒盖，使NC膜片贴紧吸水垫料。整个反应过程都在渗滤装置上进行。
 (2)试剂盒组成：IFA试剂盒的3个基本试剂成分是反应板，结合物和洗涤液。为了提供质控保证，用于抗原测定的试剂盒还应包括抗原参照品，相应的检测抗体的试剂盒应有阴性对照品。以双抗体夹心法测HCG为例，在NC膜中央滴加抗β-HCG抗体，结合物为金标记的抗β-HCG抗体。
 3、操作：
 ① 将反应板平放于实验台，于小孔内滴加标本1-2滴，待完全渗入。此时标本中的HCG与NC膜上的抗β-HCG相结合。
 ② 于小孔内滴加结合物试剂1-2滴，等完全渗入。金标记的抗β-HCG抗体与NC膜上的HCG形成双抗体夹心复合物。因胶体金为红色，在NC膜上出现红色斑点。
   ③ 于小孔内滴加洗涤液2-3滴，待完全渗入。
  ④ 判读结果：在膜中央有清晰的淡红色或红色斑点显示者判阳性反应；反之，则为阴性反应。斑点呈色的深浅相应地提示阳性强度。 
三、免疫层析试验(ICA )
 ICA是继IFA之后发起来的另一种膜固相免疫测定。与IFA利用微孔膜的过滤性能不同，ICA中滴加在膜一端的样品溶液受膜的毛细管作用向另一端移动，犹如层析一般。移动过程中被分析物与固定于膜上某一区域的受体（抗原或抗体）结合而被固相化，无关物则越过该区域而被分离，然后通过标记物的显色来判定实验结果。以胶体金为标记物的试验称为金免疫层析试验(GICA)。
1、试剂：ICA中所用的试剂全部为干试验，它们被组合在一试纸条上。试剂条的底板为一单面胶塑料片，A、B两端粘贴有吸水材料。加样端A为样品垫，可用的材料有滤纸，多孔聚乙烯和玻璃纤维等，按分析物和试剂的不同选择合适的。B端为吸水垫，材料则以吸水性强的滤纸为佳。G处为结合物垫，胶体金结合物干燥固定在玻璃纤维膜等材料上。G、B之间粘贴有吸附有受体的硝酸纤维素膜，受体（抗原或抗体）以直线形式包被在膜上。
2、操作：
   以双抗体夹心法测HCG为例。试条中G处为金标记的抗β-HCG，NC膜上T处包被抗β-HCG，C处包被抗小鼠IgG抗体。测试时在A端加尿液（或将A端浸入尿液中），通过层析作用，尿液向B端移动，流经G区时将金标记抗α- HCG抗体复溶，若尿液中含HCG，即形成抗α-HCG-HCG复合物；
移动至T区，形成金标抗α-HCG- HCG-抗β-HCG复合物，在T区显示红色线条，为阳性反应，多余的金标记抗α-HCG移动至C区时被抗小鼠IgG抗体捕获，而显示出红色质控线条。如尿液中不含HCG，在T区不出现红色线条，仅在C区出现红色线条，试验结果为阴性，如C区无红色线条出现，表示试验无效。
四、临床应用 
1、感染性疾病的抗原、抗体的检测：
     可检测的抗原有HBsAg, HBeAg，疟原虫抗原、大肠埃希杆菌抗原等。可检测的抗体有：抗结核杆菌抗体，抗幽门螺杆菌抗体，抗HBs，抗HIV抗体，抗登革热抗体，梅毒抗体等。
2、各种蛋白质的检测：甲胎蛋白、癌胚抗原、肌红蛋白、肌钙蛋白、尿蛋白、粪便血红蛋白等。
3、激素的检测：HCG、LH、FSH、TSH，其中尿HCG的检测应用最广。
4、药物检测：主要检测毒品类，如吗啡，可卡因，鸦片等。