造血干细胞移植

早在20世纪60年代就已经开展了异基因骨髓移植（allogeneic bone marrow transplantation，Allo-BMT）。为克服供者不够的困难，70年代开展了自体骨髓移植（autologous bone marrow transplantation, Auto-BMT）和胎肝移植。80年代中期开展了自体和异基因外周造血干细胞移植（Auto- & Allo-PBSCT）。由于PBSCT造血重建快，患者感染和出血的危险减少，抗生素和血制品的使用量也有所下降。采集干细胞不需麻醉与多部位穿刺，供者比较安全，易被接受。现在Auto-PBSCT已替代了Auto-BMT，Allo-PBSCT也有替代Allo-BMT的趋势。1989年Gluckmsn成功地进行了首例脐血移植（cord blood transplantation, CBT），开辟了移植所需的造血干细胞的新来源。

造血干细胞（hemapoietic stem cell, HSC）是血液和免疫系统的起始细胞。CD34是造血干/祖细胞表面的标记抗原。各种血细胞和免疫细胞如红细胞、粒细胞、单核细胞、淋巴细胞、浆细胞、巨噬细胞和血小板等，都由造血干细胞分化增殖而成。造血干细胞移植（hemapoietic stem cell transplantation, HSCT）就是将供者的造血干细胞取出体外作为移植物（graft），然后回输移植给经过预处理的受者，重建受者的造血和免疫系统的过程。预处理的超致死剂量化放疗有清除骨髓的作用，移植物有抗白血病（graft versus leukemia, GVL）和抗肿瘤（graft versus tumor, GVT）作用，在临床上可治疗与造血干细胞有关的血液系统疾病和某些恶性实体肿瘤。理论上只需要一个造血干细胞即可重建造血和免疫系统，临床上为了安全地在短期内重建一个遍布全身并具有一定功能的血液和免疫系统，则需要获得相当数量的造血干细胞才能进行成功的移植。

在胎儿期，造血干细胞分布于卵黄囊和胎肝。出生时主要分布在骨髓，外周血、胎盘和脐带血中也有分布。成年后，只分布于骨髓和外周血。根据获得造血干细胞的组织和器官，HSCT可分为胎肝移植，脐血移植（CBT），骨髓移植（BMT）和外周造血干细胞移植（PBSCT）。

造血干细胞可以来自同种异基因的个体，也可以来源于同卵双生的同种同基因的个体甚至自体。根据造血干细胞的供体，HSCT可分为自体（Auto-）移植，同种同基因（Syn-）移植和同种异基因（Allo-）移植。后者又根据供者与受者之间有无血缘关系分为血缘供者（sibling donor）移植和非血缘供者（unrelated donor）移植。

此外，根据移植前的预处理不同还可分为清髓移植（myeloablative transplantation）和非清髓移植(non-myeloablative transplantation or mini transplantation)两类。根据是否对移植物作净化处理分为一般HSCT和去T移植或纯化CD34+细胞移植。按照供受者之间的人类白细胞抗原（HLA）相配的程度又可分为HLA相配移植（HLA-matched transplantation），HLA半相合移植（haploidentical transplantation）和HLA不配移植（HLA-mismatched transplantation）。

【适应证】Allo-HSCT包括Allo-BMT、Allo-PBSCT和Allo-CBT。主要用以治疗各种累及造血干细胞的疾病。①各种白血病。急性白血病是Allo-HSCT治愈的第一种疾病。成人急性白血病和儿童高危急淋白血病应在首次缓解期进行移植，儿童标危急淋白血病则应在第二次缓解期进行。对未缓解或复发的病人进行移植效果较差，但这是病人最好的选择，有20%生存的机会。慢性粒细胞白血病的移植后果优于化疗加干扰素治疗。②急性放射病。③重型再生障碍性贫血，PNH等。④重型联合免疫缺陷病，镰状细胞贫血，Fanconi贫血和重型珠蛋白生成障碍性贫血等与造血干细胞有关的遗传性疾病。⑤对化放疗敏感的晚期淋巴瘤和实体瘤。Allo-HSCT花费大，合并症多，风险高，但复发率相对低。

自体造血干细胞移植包括自体骨髓移植、自体脐血移植和自体外周造血干细胞移植。可用于治疗各种化放疗敏感的实体瘤、淋巴瘤、白血病以及自身免疫性疾病。自体造血干细胞移植无供受体之间的免疫排斥，合并症少，较安全，花费也低。但因没有GVL，复发率较高。

【供者的选择】 供者的年龄可从8岁到65岁。供者身体应该健康。对异基因造血干细胞移植而言应选择HLA主要位点相配的供者。HLA不相合可引起植活延迟或排斥，并使早期急性GVHD发生率上升。供者以男性和未曾受孕的女性为妥。曾怀过孕的女性较易引起GVHD。脐血移植之前除了配型外，应确定胎儿无遗传性疾病。自体移植的供者就是病人自己，不需作HLA配型，但身体情况应能承受大剂量的放化疗。

异基因造血干细胞移植后移植物与宿主相互之间的免疫排斥反应是失败的主要原因之一。移植后的免疫排斥反应由6号染色体短臂上的主要组织相容复合体（MHC）基因区表达的人类白细胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）所决定，该区的I类基因HLA-A，HLA-B，HLA-C等位点和II类基因HLA-DR，HLA-DP，HLA-DQ等位点连锁形成单倍型(hyplotype)。供受者间主要位点A，B，DR任一点不合均与GVHD发生有关，其中DR位点最重要。为避免移植失败或移植成功后发生严重的移植物抗宿主病，供受者之间需要作HLA配型检查。以前用混合淋巴细胞培养（MLC）和血清法来作配型，因为MLC与GVHD性无相关性，血清法有20%~30%的误差，故多已不用。现在采用A，B，DR位点DNA分子组织配型法（SSOP或SSP）来作HLA配型检查。新的配型法使供受者的基因特征一致，提高了移植成功率，减少了GVHD的发生，并使非血缘移植的生存率达到血缘移植水平。同胞之间HLA主要位点相符的机会为四分之一，非血缘供受者之间则为万分之一。但即使HLA的主要位点完全相配，仍有30%的移植会发生GVHD。这是因为体内还存在次要组织相容抗原系统（minor histocompatibility antigen system），其位点众多，无法都做检测。故主要位点完全相配的移植仍有可能发生GVHD，预防GVHD的措施对异基因造干细胞移植是很重要的。

【造血干细胞的采集，处理和保存】  采集骨髓前先进行供者自体循环采血。先抽400ml血4℃保存，一周后，将血液回输，同时再抽600ml血液保存。如此重复，最后抽血1000ml保存，供采集骨髓时补充血容量之用。采集骨髓时要做硬膜外麻醉或全身麻醉，在髂前和髂后上棘多点穿刺，在输血的同时，抽取骨髓与血液混合物1000ml左右。所采的单个核细胞（MNC）要求达到3×108/kg（受者体重）。

因为外周血中造血干细胞含量较少，仅为骨髓的1%，所以干细胞采集前需用粒系集落刺激因子（G-CSF）进行动员。异基因供者接受皮下注射G-CSF5~10µg/kg×4~5天，然后用血细胞分离机采集。要求采集的MNC达到3×108/kg（受者体重），CD34+细胞达到3×106/kg，CFU-GM达到3×104/kg。自体外周血造血干细胞移植的供者就是患者自己，可用化疗加G-CSF的方法进行动员。化疗可进一步减少肿瘤的负荷，同时以加强了G-CSF的动员作用。化疗后白细胞开始恢复时按上述异基因供者使用的方法进行G-CSF动员和干细胞采集。外周干细胞采集物体积较小（50~200ml），供者一般不需要输血。

脐血应在分娩时结扎脐带移去胎儿后娩出胎盘前，于无菌条件下，直接从脐静脉采集，每份脐血量60~100ml左右。虽然因脐血淋巴细胞的免疫不成熟性较少引起GVHD且对HLA配型要求比较低，但由于脐血的干细胞数量有限，故脐血移植一般不适合体重大的受者。

供者和受者血型不合时，视二者不相容的情况予以处理。供者为O型或受者为AB型时称之为次要血型不合，可以不予处理。其他血型不合为主要血型不合，会引起移植后溶血。可选择受者血浆置换，用供者红细胞使受者脱敏或用羟乙基淀粉沉降并除去移植物中的红细胞等三种方法之一进行处理。以最后一法为常用。

为减少GVHD的危害，可用抗CD34+单克隆抗体在临床细胞分选仪（CliniMACS）中对移植物的CD34+细胞进行正选择，做纯化CD34+细胞移植；或用单抗去除移植物中的T细胞后再进行移植。但是去T细胞移植后可能会增加移植物被排斥，可因GVL缺乏增加白血病复发，而免疫重建延迟可增加各种感染合并症发生的机会。

骨髓液、外周造血干细胞或脐血可以在4℃保存72h。如加入冷冻保护剂（10%二甲基亚砜）以每分钟降1℃的速率程控降温，降到-60℃后放在液氮（-196℃）中超低温长期保存。骨髓液容量高达1000ml以上，可以仅保存血细胞分离机从骨髓液中分离所得的有核细胞，其体积可减少85%。虽然此时干细胞会有损失，但CFU-GM有85%的回收率。

【受者的准备】  确定患者有移植的适应证，年龄一般不大于45~50岁，无器质性疾病和精神病。患者和家属应了解移植的危险并准备足够经费。

患者经过全身无菌和胃肠道除菌后进入无菌层流病房。移植相关的无菌技术是医院中最严格的，是移植后处于免疫缺陷状态的患者度过危险期的重要保证。移植前患者必须接受预处理。预处理的目的有三：一为清除骨髓或体内恶性细胞克隆。二为抑制或清除受者体内免疫细胞，保证移植物不被排斥。三为减少受者的造血干细胞，为供者的造血干细胞归巢提供空间，促进移植成功。构成Allo-HSCT的预处理方案的药物有免疫抑制药如抗胸腺球蛋白（ATG）和抗CD3单克隆抗体等；抗肿瘤药如大剂量的环磷酰胺（CTX），白消安，美法仑和阿糖胞苷（Ara-C）等。还可加用超致死剂量放疗，放疗的形式有全身放疗（TBI），分次全身放疗（FrTBI）和全淋巴照射（TLI）。治疗骨髓瘤时还可采用大剂量（20Gy）同位素153Sm内照射。自体干细胞移植的预处理方案仅由大剂量的抗肿瘤药物和放疗组成。预处理的毒副作用包括出血性膀胱炎、粘膜病、肺损害、不育、肝静脉阻塞病、间质性肺炎等。

经典方案：

①FrTBI 8~12Gy，CTX 60mg/kg×2天，VP16 30mg/kg

②白消安4mg/kg×4天，CTX 60mg/kg×2天

③BCNU 300mg/m2第一天，VP16 75mg/m2×4天，Ara-C 200mg/m2×4天，美法仑140mg/m2，第四天（BEAM方案，主要用于淋巴瘤的治疗）

【干细胞移植回输和植活的证据】 骨髓液应在采集后6h之内回输。每袋的最后10ml应弃去，以避免脂肪栓塞。因为骨髓液容量较大，其抗凝的肝素也较多，要用等量的鱼精蛋白来中和。采集的外周血干细胞和脐血可以直接回输。液氮冷冻保存的骨髓，外周血干细胞或脐血可在使用前放在40℃水浴中快速融解后回输。

异基因移植物植活的直接证据为出现供者的染色体核型，供者DNA多态性特征和供者的DNA可变重复区（D1S80等）顺序等，间接证据包括测到供者的HLA型，供者的血型和发生GVHD等。自体移植时只有植活才能重建造血和免疫系统。

【回输后的处理】 干细胞回输后的处理有以下几个方面。

一、促使干细胞分化增殖，维持血液系统的功能  可使用G-CSF，GM-CSF和EPO等细胞因子促使干细胞分化增殖，加速造血重建。因预处理的超大剂量放化疗使患者受到了很大的伤害，白细胞下降到零处于免疫缺陷状态，故极易发生各种细菌、病毒和真菌感染。预防感染主要靠病室的洁净和无菌护理。患者在停止输血和输液2h后体温仍在38.5℃以上时，应首先考虑感染的可能。除了确定感染部位，采集标本送培养外，要注意使用广谱抗生素控制感染。如72h内体温恢复正常，可继续使用该抗生素，3天后停药。如体温不退，应根据药敏的结果调整抗生素的种类。除了细菌感染还要想到病毒或真菌感染的可能，必要时可考虑使用静脉用免疫球蛋白（IVIG）。此外，在造血功能尚未恢复时，还应输血小板预防出血和输红细胞纠正贫血。为防止输血引起的GVHD，血制品均需经20~30Gy照射。合理地使用抗生素和血制品可以在一定程度上维持血液系统的功能。

二、GVHD的预防  GVHD是异基因造血干细胞移植时常见的并发症，其严重程度与输入的淋巴细胞数量和HLA配型有关。故最好的预防GVHD措施是移植前做好HLA配型和去除移植物中的T细胞。移植后通常采用抑制T细胞功能的预防GVHD方案。移植后，MTX 10mg/m2每周一次静脉注射，共一个月。环孢素3~4mg/kg静滴，每日一次。能耐受口服时，改为9~12mg/kg分次口服。如无GVHD，40天后开始减量，每周减5%，6 个月后完全停药。用药期间保持CSA的血清浓度处于30~200ng/ml为宜。用药过程中如病人的血肌酐超过177µmol/L则须完全停药。也可采用CSA与甲泼尼龙，泼尼松或吗替考酚酯（MMF）组成预防方案。临床试验表明阻断免疫信息传递如抑制共刺激分子CD40，CD28的表达或用抗CD20的单抗去除受者体内起抗原提呈细胞（APC）作用的B细胞也有较好的预防GVHD的作用。

三、处理移植后的并发症  异基因移植后100天内出现的GVHD称为急性GVHD（aGVHD），患者出现皮疹、腹泻和黄疸。如果皮诊面积超过体表的50%或胆红素6mg/dl或腹泻量1500ml时提示GVHD已进入三度以上，这是病危的信号。大剂量甲泼尼龙和ATG治疗aGVHD有效。严重的病例需甲泼尼龙2mg/kg·d，GVHD控制之后每周减量10%。随机研究表明加大激素起始治疗剂量和延长减量的时间并无益处。无效者应用1g静脉冲击，连用3~5天；抗CD25单抗和较大剂量的CSA也有治疗aGVHD的作用。aGVHD反复发作和免疫抑制药物的反复使用往往会引起间质性肺炎。Ganciclovir(DHPG)对巨细胞病毒引起的间质性肺炎有效，SMZ对肺孢子虫引起的间质性肺炎有效，IVIG对二者均有效，但是预后并不乐观。100天以后发生的GVHD称慢性GVHD（cGVHD）。cGVHD类似自身免疫性疾病。局限性cGVHD表现为各种皮肤病和肝功能损害。广泛性c