细胞化学染色检验
  细胞化学是组织学的一个分支，是在细胞形态学的基础上研究细胞的生物化学成分,及其定位、定量及代谢功能状态的学科。在细胞形态学的基础上，运用化学反应的原理对血细胞内的各种生化组成及其代谢产物（酶类、脂类、糖类、铁、蛋白质、核酸等）作定性、定位、半定量分析的方法。
细胞化学染色临床上主要用于：①辅助判断白血病的细胞类型。白血病的诊断以形态学为基础，但有时仅采用瑞式染色是难以判断白血病细胞的类型的。不同的细胞系列，其所含的化学物质成分、含量及分布各不相同，随着细胞的分化阶段及病理生理状态变化，这些物质的含量也会发生相应改变。因此根据细胞化学染色结果的不同，可推断细胞的所属系列。因此临床上细胞化学染色成为辅助诊断白血病必要的、有力的手段。②其他血液系统疾病的诊断和鉴别诊断。在病理情况下，血细胞的化学物质的成分及含量会发生改变，据此可以辅助疾病的鉴别诊断。如中性粒细胞碱性磷酸酶染色、铁染色等。③观察疾病的疗效和预后。当病理状况纠正后，血细胞的化学物质的成分及含量会发生改变。④发病机制的研究。
细胞化学染色的基本步骤为固定、显示及复染。不同的细胞化学染色，步骤不同。
1、 固定 为了保持细胞结构及化学成分的不变，需要对细胞进行固定。根据染色的成分不同，选择合适的固定液，使细胞内的蛋白质、酶类、糖等变成不溶性物质。固定的方法有物理法和化学法，临床常用化学法固定。物理法包括干燥和火焰固定，化学法包括甲醛、乙醇、甲醇、丙酮等固定。采用蒸气或液体固定。
（1）蒸气固定：甲醛是常用的固定剂，极易挥发、氧化，常用40％甲醛蒸气固定。方法为在封闭的玻璃器皿中加入40％甲醛，将涂片血膜朝下，固定5～10分钟。
（2）液体固定： 将涂片浸在甲醛、乙醇、甲醇、丙酮等固定液中，也可将两种或两种以上固定液混合，如10％甲醛甲醇液，甲醛丙酮液等。
2、 显示 通过不同的化学反应，形成稳定的有色沉淀，显示出被检测的化学物质。常用的化学反应种类有以下几种：
（1） 偶氮偶联法：含萘酚的底物，在相应酶的作用下释放出萘酚，后者与重氮盐结合，偶氮偶联形成有色沉淀。重氮盐的种类有坚牢蓝紫酱GBC、坚牢蓝B、六氮偶付品红等。中性粒细胞碱性磷酸酶染色、特异性酯酶染色、非特异性酯酶染色、酸性磷酸酶染色等。
（2） 联苯胺法：过氧化物酶染色采用此法。粒细胞和单核细胞中的过氧化物酶（主要是髓过氧化物酶），能分解过氧化氢释放出新生态氧，使无色的联苯胺氧化形成有色沉淀。
（3） 普鲁士蓝反应：细胞内外的铁与酸性亚铁氰化钾作用，形成亚铁氰化钾蓝色沉淀，如铁染色。
（4） 雪夫反应：过碘酸氧化细胞内糖类中的乙二醇基形成乙二醛基，醛基与雪夫试剂作用，使无色品红形成红色沉淀物，如过碘酸－雪夫反应。
（5） 金属沉淀法：某些金属化合物有颜色，形成沉淀后可以显示相应的物质，如钙－钴法中性粒细胞碱性磷酸酶染色。
3、 复染 显色反应只是针对细胞中的特定物质，要显现细胞的形态还需要用其他染液对细胞进行复染。所选择的复染液染色的结果应使细胞结构清晰，且应与有色沉淀有明显的对比度。对细胞核着色效果较好的有中性红、甲基绿、苏木精、核固红、沙黄等，使浆着色较好的有伊红、刚果红、光绿等。
复染后首先观察正常应为强阳性的细胞，如过氧化物酶染色观察中性粒细胞是否强阳性，如该类细胞结构清晰，对比度良好，说明染色成功，可进一步观察计数其他细胞的染色情况。
影响细胞化学染色结果的因素众多，主要有：标本的制备和保存方式；固定目的和固定剂的选择；酶作用底物的特异性及其选择、酶反应的最适时间、温度和PH值；抑制物如NaF、酒石酸和活化剂如钙离子、镁离子的选择和控制；储备液和缓冲剂的制备及保存方法；阳性率和半定量积分的计算方法。每一步都必须力求精准，方能获得可信的结果。
细胞化学染色方法众多，常用的有过氧化物酶染色、苏丹黑B染色、酯酶染色、过碘酸－雪夫染色、中性粒细胞碱性磷酸酶染色、酸性磷酸酶和抗酒酸酸性磷酸酶染色、骨髓铁染色等。目前还发展了上述染色法在同一张标本上的双染色，可提高分型的准确率。下面介绍这几种染色法的原理和临床意义。
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一、过氧化物酶染色(Peroxidase，POX)
【原理】过氧化物酶(Peroxidase，POX)是广泛存在于生物体中的一类酶,大部分含有血红素，是一种结合蛋白。它可以催化H2O2或相关有机过氧化合物与有机、无机化合物的氧化反应。血细胞所含过氧化物酶主要为髓过氧化物酶(MPO)，MPO是一类糖蛋白，是人类中性粒细胞含量最多的蛋白质，约占细胞干重的3%～5%。用MPO PHMPZE探针与正常人染色体中期细胞作原位杂交，证明MPO基因定位在染色体17q11～q22，为单拷贝基因。对HL60细胞系中MPO的生物合成和加工过程研究发现，最初产生的MPO是分子量为89，000的前体，有大、小亚单位各一个，对内糖苷酶敏感，无MPO活性，MPO前体还需进一步进入溶酶体，经蛋白切割后才能成熟并具有活性。这提示MPO前体转录时或转录后的加工缺陷可产生异常的MPO，使后者在早幼粒细胞发育过程中不能包装到嗜苯胺蓝颗粒中。在临床白血病研究中，用全长MPO cDNA作探针进行RNA印迹法杂交，或用MPO cDNA探针作反转录聚合酶链反应(RT-PCR)或用原位杂交，证明AML表达MPO mRNA，但ALL无一表达MPO mRNA。在早期原始细胞尚无颗粒时可在核膜、内质网上发现其阳性物，此时在光镜下则难以识别出来，用电镜可观察到部分细胞显示阳性。髓过氧化物酶是嗜天青颗粒中一种溶酶体酶,主要存在于线粒体和溶酶体中，主其能是破坏生物氧化过程中有巨毒的过氧化物，使其放出氧，参加细胞内氧化还原过程，是一种与生物氧化有关的重要酶类。
1985年血液学国际标准化委员会(ICSH)推荐三种方法：二氨基联苯胺法(DAB染色法)；过氧化酶氨基-甲基卡巴唑染色法；二盐酸联苯胺法。二氨基联苯胺染色是常用的方法，细胞颗粒中的过氧化酶，能将过氧化氢中的氧释放出来，氧化二氨基联苯胺(DAB)，形成金黄色沉淀而定位于过氧化酶活性的部位。
【染色结果及正常血细胞反应】细胞质中无金黄色颗粒者为阴性反应。颗粒细小而稀疏为弱阳性，颗粒较粗分布较密集者为阳性反应；颗粒粗大密集为强阳性。
1． 原粒细胞POX 阴性或弱阳性反应，早幼粒细胞以下阶段随着细胞分化成熟而增强，中幼粒和晚幼粒细胞阳性物充满胞浆，少部分盖在细胞核上。
2． 嗜酸粒细胞POX呈强阳性。嗜碱性粒细胞阴性或弱阳性。
3． 原始单核细胞缺乏POX活性，呈阴性和弱阳性。幼稚单核细胞呈阴性或弱阳性反应，阳性反应物颗粒细小，散在分布于细胞浆与细胞核上。
4． 淋巴细胞、原始及幼稚巨核细胞、浆细胞、高雪氏细胞、尼曼－匹克细胞、组织嗜碱细胞、原红及幼红细胞POX阴性；网状细胞、海兰细胞POX 阴性或阳性。
5． 遗传性过氧化物酶缺乏症，除嗜酸粒细胞不受影响外，中性粒细胞与单核细胞POX缺乏或减低。
【临床意义】过氧化物酶染色是临床最常用和最有价值的鉴别白血病类型的细胞化学染色方法。主要用于急性淋巴细胞白血病（ALL）与急性非淋巴细胞白血病（ANLL）的鉴别。
1． 急性白血病时POX反应强弱顺序M3> M2b> M2a> M6(粒)> M4 >M1> M5> HAL>ALL.急性淋巴细胞白血病和CLL POX均为阴性。50年代至今有人主张POX<3%或<5%为ALL，随着免疫技术的发展，检测手段增多，提示我们POX阳性率低时，多考虑急性混合型白血病或未分化白血病（M0），后者利用电子显微镜可观察到细胞浆中有阳性小颗粒。
2． 急性粒细胞白血病时，白血病细胞常呈阳性，M2b POX表现为强阳性，部分M2b中异常中幼粒细胞POX阳性物在细胞核的凹陷处聚集成团，呈团块状反应(图1)。急性早幼粒细胞白血病(APL)POX呈强阳性反应。阳性物深棕黄色充满胞浆，细胞外浆一般为阴性。有个别M3也表现出阴性，可能由于在转录过程中出现异常，如还有一部分呈现强阳性，这提示POX基因的表达并不完全丧失，可能是由于部分转录(transcribed)或产生了不稳定的无效RNA所致。
3． 急性单核细胞白血病时呈弱阳性或阴性。ANLL中Auer小体POX阳性。有人报道ANLL患者出现严重感染时中性粒细胞会出现POX缺乏。

图1 M2bMPO部分呈团块状强阳性反应
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二、 苏丹黑B染色（sudan black B,SBB）
【原理】苏丹黑B（sudan black B,SBB）是一种脂溶性重氮染料，能溶解于细胞内含脂质的结构中，使脂类物质呈现棕黑或深黑色。
【染色结果及正常血细胞反应】阳性结果为细胞中出现棕黑或深黑色颗粒。
1． 各种血细胞SBB染色结果与POX染色大致相似。
2． 分化差的原始粒细胞为阴性，分化较好的原始粒细胞在核旁Golgi器区域开始出现阳性颗粒，随细胞分化成熟阳性颗粒增大增粗。
3． 嗜酸粒细胞阳性颗粒粗大，染色偏棕色，颗粒周边染色深，中心为蛋白质组成的不着色区。
4． 嗜碱细胞阴性或阳性，阳性颗粒大小不一。
5． 单核细胞染色阴性或弱阳性，颗粒细小，分布弥散。
6． 淋巴细胞、幼红细胞、巨核细胞、浆细胞、高雪细胞阴性。网状细胞、海蓝细胞阴性或弱阳性。
【临床意义】在急性白血病的鉴别意义上苏丹黑B染色与POX基本一致。
1． 阳性强弱次序在急性白血病与POX基本一致，阳性强弱次序相同，即M3> M2b> M2a> M6(粒)> M4>M1>M5>HAL>ALL。
2． 苏丹黑B染色比POX阳性颗粒出现早，反应强，更敏感。但国内外均有报道ALL可呈现弱阳性，颗粒细小，可能是线粒体酯酶所致，因此不可仅凭苏丹黑B染色区分形态上难以鉴别的ALL和ANLL，如按传统FAB分型的ALL-L2与ANLL-M1。 返回
三、酯酶染色(Esterase)
酯酶属水解酶，是一组在不同pH条件下，水解各种脂肪族或芳香族酯类的酶。根据酯酶存在的细胞类型、催化底物和pH不同，可分成特异性酯酶和非特异性酯酶两大类。水解短链脂肪酸酯为非特异性酯酶，萘AS-D氯乙酸盐作底物为特异性酯酶。人血细胞含有九种酯酶同工酶，不同的血细胞所含同工酶亦不相同。
(一) 特异性酯酶(naphthol AS-D chloroacetate esterase, SPE，CE)
【原理】细胞内的氯乙酸AS-D萘酚酯酶(naphthol AS-D chloroacetate esterase)，可将氯乙酸AS-D萘酚进行水解，释放出AS-D萘酚，后者与重氮盐偶联产生不溶性有色沉淀，定位于胞质内。国际血细胞标准化委员会1985年推荐固紫酱GBC法(Fast garnert GBC salt)和新品红方法 (New Funchisn ，前者更为常用，产生的沉淀物为红色。CE通常看成是粒细胞及肥大细胞的标志酶，很多报道都强调了它对粒细胞有较强的特异性，因此被称作特异性酯酶。
【染色结果及正常血细胞反应】细胞质中出现红色沉淀者为阳性反应。
1． 该酶主要存在于中性粒细胞中。
2． 原始粒细胞一般阴性，少部分可见弱阳性反应。自早幼粒至成熟中性粒细胞均呈阳性反应。以早幼粒和中幼粒反应最强，阳性物充满胞浆，酶活性并不随着细胞的成熟而增强，而是减弱。
3． 嗜碱粒细胞阴性，个别弱阳性。嗜酸粒细胞阴性或弱阳性。
4． 单核细胞多为阴性，偶呈弱阳性反应，阳性物为颗粒散在分布。
5． 淋巴细胞通常阴性，但自然杀伤（NK）细胞阳性率约在50%左右。
6． 幼红细胞、巨核细胞、血小板、高雪细胞和尼曼－匹克细胞、浆细胞阴性。海蓝细胞阴性或弱阳性。组织嗜碱细胞（肥大细胞）强阳性（图2）。
【临床意义】特异性酯酶染色是临床常用的辅助鉴别急性白血病类型的化学染色方法，主要用于急性粒细胞白血病与其他白血病的鉴别。
1． 急性粒细胞白血病：原粒细胞多呈阳性，少数阴性，因此阴性结果不能排除急性粒细胞白血病可能。M3异常早幼粒细胞呈强阳性，易见柴束样结晶。部分M2b细胞核的凹陷处呈团块状反应（图3）。髓系白血病中Auer小体特异性酯酶可呈阳性。
2． 慢性粒细胞白血病急性变时酶活性增强。
3． 单核细胞白血病时原始及幼稚单核细胞多为阴性，偶呈弱阳性反应，阳性物为颗粒散在分布。急性粒－单细胞白血病部分白血病细胞阳性，部分阴性。
4． 急性淋巴细胞白血病阴性，但自然杀伤（NK）细胞白血病50％阳性,可作为大颗粒淋巴细胞白血病的诊断依据之一（图4）。
5． 急性巨核细胞白血病阴性。

图2组织嗜碱细胞CE强阳性 图3 M2b CE部分呈团块状反应

图4 NK细胞50Î为阳性
(二)非特异性酯酶(Non-Specific Esterase)
非特异性酯酶是一组在酸性、中性和碱性pH条件下，水解各种短链脂肪酸酯或芳香族酯的酶。几乎存在于所有血细胞，包括巨核细胞、浆细胞，甚至上皮细胞的溶酶体内。根据pH不同分中性非特异性酯酶；酸性非特异性酯酶；碱性非特异性酯酶。底物有：α-醋酸萘酚酯酶 (α-Naphthyl acetate esterase, α-NAE)；萘酚AS醋酸酯酶 (Naphthyl AS acetate esterase, NASAE)；萘酚AS-D醋酸酯酶 (Naphthyl AS-D acetate esterase, NAS-DAE)；α-丁酸萘酚酯酶 (α-Naphthyl Batyrate esterase, α- NBE)。重氮盐有：坚牢蓝B；固蓝BB；六偶氮付品红等。
1. α-醋酸萘酚酯酶(α-Naphthol acetate esterase，α-NAE)
【原理】在中性条件下，血细胞内的α-萘酚醋酸酯酶将醋酸萘酚水解，产生酚，再与重氮盐偶联，产生不溶性的有色沉淀。本试验常用的重氮盐为六偶氮付品红，形成的沉淀为红色。α-萘酚醋酸酯酶存在于单核细胞、粒细胞和淋巴细胞中，因此是一种中性非特异性酯酶。单核细胞的阳性反应可被NaF抑制，因此常同时作NaF抑制试验。
【染色结果及正常血细胞反应】细胞质中出现棕红色或暗红色颗粒状或弥散絮状沉淀者为阳性反应。
1． 原始单核细胞α-NAE阳性率及强度低，幼稚单核细胞可呈阴性、弱阳性和强阳性，成熟单核细胞阳性（图5）。阳性物颜色鲜艳呈细小颗粒弥散状，加NaF后阳性率及指数明显降低或为阴性。
2． 粒细胞一般为阴性或弱阳性反应，不被NaF抑制。
3． T淋巴细胞呈阳性反应，为点状阳性沉淀。B淋巴细胞阴性。
4． 有核红细胞多为阴性，少数弱阳性。
5． 巨核细胞、血小板α-NAE呈阳性；网状细胞α-NAE呈较强的阳性反应，阳性物多呈弥散状；浆细胞α-NAE呈强阳性，阳性反应物颗粒粗大或呈珠状；高雪、海兰等一些非造血细胞为强阳性反应且不被NaF抑制。

图5 单核细胞α-NAE强阳性
【临床意义】α-萘酚醋酸酯酶反应常被用于急性单核细胞白血病与急性粒细胞白血病的鉴别。
1． 急性单核细胞白血病白血病细胞呈强阳性反应，酶活性可被NaF抑制。
2． 急性粒－单细胞白血病部分白血病细胞阳性，部分阴性，氟化钠抑制率与两类细胞的比例相关。
3． 急性粒细胞白血病呈阴性或弱阳性，不被NaF抑制。M3部分可呈强阳性反应，阳性物弥散型分不清颗粒，不被NaF抑制。也用于T细胞型和B细胞型急性淋巴细胞白血病的鉴别，前者为阳性反应，后者为阴性反应。但T细胞型慢性淋巴细胞白血病多呈阴性，故不能用于区别T与B细胞型慢性淋巴细胞白血病。
氟化钠抑制指反应液中加入氟化钠（终浓度15mg/10ml），抑制率大于等于50％为受抑制，计算公式为：氟化钠抑制率＝（抑制前阳性率或阳性积分－抑制后阳性率或阳性积分）÷抑制前阳性率或阳性积分×100％。单核细胞、巨核细胞、血小板、浆细胞受抑制；淋巴细胞、粒细胞、有核红细胞不受抑制。有时α-萘酚醋酸酯酶反应可出现假阳性，有时细胞的阳性程度弱，如非差异显著，抑制情况难以判断，因此在试验操作和结果判断时都须谨慎。
2.α-丁酸萘酚酯酶染色(alpha—naphthyl butyrate esterase，α-NBE)
【原理】：血细胞中的α-丁酸萘酚酯酶，在PH中性的条件下，能将基质液中的α-丁酸萘酚水解产生α-萘酚，后者与重氮盐偶联形成不溶性沉淀，定位于胞质内。常用的重氮盐为坚牢紫酱GBC，形成的沉淀为红色。α-NBE主要存在于单核细胞中，阳性反应可被氟化钠抑制，其他系列细胞的阳性反应不被抑制。
【染色结果及正常血细胞反应】阳性反应为细胞质中出现红色沉淀。
1． 原粒细胞和早幼粒细胞呈阴性反应，中幼粒及晚幼 粒细胞可见弱阳性反应，不被氟化钠抑制。
2． 原始和幼单核细胞α-NBE多呈强阳性反应，能被氟化钠抑制，部分可见弱阳性和阴性。
3． 外周血B淋巴细胞阴性，T淋巴细胞和非T非B淋巴细胞可呈阳性。
4． 巨核细胞、幼红细胞、浆细胞阴性，少数可见弱阳性反应。
5． 组织细胞可呈强阳性，但不被氟化钠抑制。
【临床意义】α-萘酚丁酸酯酶较其它底物对于单核细胞特异性强，灵敏度差。
1． 单核细胞白血病白血病细胞α-NBE多呈强阳性反应(图6)，能被氟化钠抑制。急性粒－单细胞白血病部分白血病细胞阳性，部分阴性。
2． 急性粒细胞白血病、急性淋巴细胞白血病一般呈阴性, 后者少数呈灶性细颗粒阳性。
3． 恶性组织细胞病可呈强阳性，但不被氟化钠抑制。
4． 毛细胞白血病α-NBE呈细小颗粒弥散分布的阳性反应，亦可聚成半月形的粗颗粒，不被氟化钠抑制。
5． 巨核细胞阴性，少数可见弱阳性反应。用此实验来区别单核细胞和巨核细胞。

图6 单核细胞α-NBE多呈强阳性
3.醋酸AS-D萘酚酯酶(Naphthol AS-D acetate esterase，AS-D NAE)
【原理】血细胞内的醋酸AS-D萘酚酯酶(Naphthol AS-D acetate esterase，AS-D NAE)在PH中性的条件下水解基质液醋酸AS-D萘酚，释放出AS-D萘酚，后者与重氮盐偶联形成不溶性的有色沉淀，定位于细胞内酶所在的部位。常用重氮盐坚牢蓝BB，形成的有色沉淀为蓝色。醋酸AS-D萘酚酯酶存在于单核细胞、粒细胞和淋巴细胞中，因此是一种中性非特异性酯酶。单核细胞的阳性反应可被NaF抑制，因此常同时作NaF抑制试验。
【染色结果及正常血细胞反应】阳性反应为细胞质中出现蓝色沉淀。
1． 原粒细胞阴性或阳性，早幼粒细胞至成熟中性粒细胞呈阳性反应，不被氟化钠抑制。
2． 原始单核细胞阴性或阳性，幼单核细胞和成熟单核细胞均呈阳性，能被氟化钠抑制。
3． 淋巴细胞阴性或阳性，不被氟化钠抑制。
4． 巨核细胞、血小板均呈阳性。
5． 早期幼红细胞呈阳性，随着细胞的成熟阳性程度逐渐减弱、此反应不被氟化钠抑制。
【临床意义】临床意义基本同α-NAE染色，可用于辅助诊断急性白血病类型。
1． 急性单核细胞白血病，单核系细胞阳性，此反应能被氟化钠抑制。急性粒－单细胞白血病部分白血病细胞阳性，部分阴性，氟化钠抑制率与两类细胞的比例相关。
2． 急性粒细胞白血病之原粒细胞可阳性，此反应不被氟化钠抑制。急性早幼粒细胞白血病，颗粒异常增多的早幼粒细胞呈强阳性，此反应不被氟化钠抑制。
3． 急性淋巴细胞白血病，白血病细胞呈弱阳性或阳性，此反应不被氟化钠抑制。
4．酸性α-醋酸萘酚酯酶(acid α-Naphthyl acetate esterase, ANAE)
【原理】血细胞中的酸性α-醋酸萘酚酯酶(acid α-Naphthyl acetate esterase, ANAE)在PH弱酸性（PH5.8）的条件下，水解基质液中的α-醋酸萘酚，产生α-萘酚，萘酚与六偶氮付品红形成红色的沉淀。
【染色结果及正常血细胞反应】阳性反应为细胞中出现蓝色沉淀。
1． 单核系细胞常呈强阳性。
2． T淋巴细胞阳性，B淋巴细胞多数为阴性。
3． 粒系细胞、红系细胞、巨核系细胞含量较少。
【临床意义】酸性α-醋酸萘酚酯酶(acid α-Naphthyl acetate esterase, ANAE)染色主要用于单核细胞白血病与其他白血病的鉴别。
1． 急性单核细胞白血病呈强阳性（弥散分布）。
2． 急性粒细胞白血病常呈阴性或弱阳性，急性早幼粒细胞白血病呈较强阳性反应（弥散分布）。
3． 急性T淋巴细胞白血病时，常呈点状颗粒或块状阳性。
4． 临床曾用于鉴别T、B淋巴细胞，现在T、B淋巴细胞的鉴别主要用流式细胞仪进行，所以该染色法已很少采用。用于T、B淋巴细胞的鉴别时，成熟T细胞呈点状颗粒或块状阳性，B细胞大多阴性，偶见稀疏、弥散的细小颗粒。

5. 酯酶双染色
在同一张涂片上进行两种酯酶染色称为酯酶双染色。可采用特异性酯酶和一种非特异酯酶染色。常用的为氯乙酸AS-D萘酚酯酶和α-萘酚丁酸酯酶。反应原理基本上与各自的染色原理，同一张涂片上的血细胞要分别在两种不同的基质液中反应一段时间，然后复染观察。酯酶双染色时，急性粒－单细胞白血病同一张涂片上出现两种酯酶染色阳性的细胞，或者同一种细胞呈现两种酯酶染色阳性，而其他急性白血病不具备此特征，因此酯酶双染色对辅助诊断急性粒－单细胞白血病有独特的价值。 返回
四、过碘酸－雪夫染色（periodic acid-Schiff staining PAS）
【原理】过碘酸-碱性品红中的过碘酸是氧化剂，可以打开多糖类物质（糖原、糖蛋白、粘多糖、粘蛋白及糖脂）的乙二醇基CHOH-CHOH，形成双醛基（CHO-CHO），后者与雪夫试剂(schiff)中的无色碱性品红结合成紫红色化合物。
【染色结果及正常血细胞反应】PAS阳性结果：胞浆内出现紫红色颗粒、珠状、块状或片状，细胞核为蓝色。
1． 粒细胞系统：分化差的原始粒细胞为阴性，分化好的原始粒细胞至中性分叶核粒细胞均呈阳性反应，随着细胞的成熟，阳性反应程度逐渐增强，阳性呈细颗粒、均匀红色；嗜酸性粒细胞中的嗜酸性颗粒不着色，颗粒之间的胞质呈红色，嗜碱性粒细胞中的嗜碱性颗粒呈阳性，而颗粒之间的胞质不着色。
2． 红细胞系统：幼红细胞及成熟红细胞均呈阴性。
3． 单核细胞系统：分化差的原单细胞为阴性，其他呈阳性，大多数阳性为细颗粒状，有时分布于细胞边缘的颗粒较粗大。
4． 淋巴细胞系统：大多数阴性，少数阳性，阳性颗粒呈粗颗粒或珠、块状。
5． 巨核细胞系统：巨核细胞、血小板阳性，呈粗颗粒或珠、块状。
6． 其他细胞：浆细胞一般阴性，少数阳性，呈细颗粒状；巨嗜细胞可为阳性，呈细颗粒状。

图7 ALL PAS呈珠状和块状 图8 M3细胞PAS易见柴束状结晶

图9 AHL PAS 图10 高雪细胞PAS呈强阳性

【临床意义
1． 急性淋巴细胞白血病：原、幼淋细胞PAS阴性或阳性，阳性率升高，阳性反应物多呈中粗颗粒、粗颗粒散在分布；珠状和块状围绕核周(图7)。慢性淋巴细胞白血病时淋巴细胞的阳性率增加，呈粗颗粒状或块状；恶性淋巴瘤时淋巴瘤细胞阳性率高、阳性强、呈块状或粗颗粒状；Reed-Sternberg细胞则为弱阳性或阴性反应。
2． 急性粒细胞白血病：原粒及早幼粒细胞呈阴性或弱阳性，阳性反应物多为细颗粒弥散状。异常早幼粒细胞的PAS反应呈强阳性，阳性反应物为密集的细颗粒弥散状，胞浆边缘及外浆处多分布粗大颗粒，大部分病例细胞胞浆内易见柴束状结晶(图8)，少数病例在细颗粒弥散状基础上可见1～2个小珠。
3． 单核细胞白血病：原、幼单核细胞PAS较粒细胞强，阳性反应呈细颗粒弥散分布，部分夹杂中粗颗粒、粗颗粒，胞质边缘及伪足处呈大粗颗粒，少部分在此基础上可见小珠，少数可见裙边样反应。
4． M4EO异常嗜酸粒细胞：PAS可见深粉红色小珠。ANLL Auer小体PAS阳性。
5． 微分化型AL(M0)：PAS可为细颗粒、中粗颗粒散在分布；部分在此基础上可见小珠。
6． 红细红胞系统疾病：红血病、红白血病、骨髓增生异常综合征中幼红细胞可阳性（呈均匀红色或块状），有时幼红细胞阳性反应强且阳性率高，甚至红细胞也呈阳性。在某些红系良性疾病，如缺铁性贫血、地中海贫血中幼红细胞可阳性，有时阳性率也较高；巨幼细胞贫血、溶血性贫血、再生障碍性贫血等幼红细胞可阴性，有时个别细胞可呈阳性。
7． 巨核细胞白血病：原始巨核细胞PAS呈阴性或阳性反应，部分为细颗粒弥散状，部分表现为强阳性，阳性反应物为中粗颗粒、粗颗粒散在分布，部分可见小珠或块状。小巨核细胞PAS呈细小颗粒弥散状，边缘处为粗颗粒及小珠。
8． 嗜碱粒细胞白血病的嗜碱粒细胞PAS为强阳性，阳性物多表现粗颗粒、珠状、块状。与幼稚淋巴细胞PAS较难鉴别。
9． AHL： PAS部分细胞呈细颗粒弥散状，部分细胞呈粗颗粒、珠状(图9)。
10． 浆细胞PAS弱阳性，一般呈淡粉色看不清颗粒，极少数病例可见粗颗粒和小珠。
11． 高雪细胞PAS呈强阳性反应(图10)；尼曼-匹克细胞为阴性或弱阳性，空泡中心阴性。以此鉴别高雪细胞和尼曼-匹克细胞。
12． 骨髓转移瘤细胞PAS大部分呈强阳性；腺癌细胞PAS呈强阳性反应，表现为红色颗粒或块状。
13． 组织嗜碱细胞PAS强阳性，细颗粒弥散状，部分可见大粗颗粒。 返回
五、中性粒细胞碱性磷酸酶染色(neutrophilic alkaline phosphatase,NAP)
【原理】中性粒细胞碱性磷酸酶 (neutrophilic alkaline phosphatase,NAP)染色的方法有Gomori钙－钴法和Kaplow偶氮偶联法。Gomori钙－钴法染色原理是碱性磷酸酶在碱性条件下将基质操作液中的ß－甘油磷酸钠水解，产生磷酸钠，磷酸钠依次与硝酸钙、硝酸钴、硫化胺产生一系列反应，形成不溶性棕黑色沉淀，定位于酶活性所在部位。较为繁琐、所需时间长。
Kaplow偶氮偶联法：成熟中性粒细胞碱性磷酸酶在PH9.6左右的碱性环境中，能水解基质液中的磷酸萘酚钠底物，释放出萘酚，后者与重氮盐偶联，生成不溶性的有色沉淀，定位于细胞质酶活性所在之处。该方法为目前所常采用。不同的底物与重氮盐的组合不同，化学反应过程以α-醋酸萘酚钠为例
【染色结果及正常血细胞反应】阳性反应为细胞质中出现不溶性灰黑色到棕黑色颗粒。NAP主要存在于中性成熟粒细胞（包括中性杆状核粒细胞和分叶核粒细胞），呈阳性反应，其他细胞基本呈阴性。反应结果以阳性反应细胞的百分率和积分值来表示。反应强度分为5级，其分级及积分值如下：
－，0分，细胞质中无阳性反应颗粒。
＋，1分，细胞质中含少量阳性反应颗粒或细胞质呈弥漫浅灰色。
2＋，2分，细胞质中含中等量阳性反应颗粒或细胞质呈弥漫灰黑色。
3＋，3分，细胞质中含较多阳性反应颗粒或细胞质呈弥漫棕黑色。
4＋，4分，细胞质中充满粗大阳性反应颗粒，甚至遮盖细胞核，或细胞质呈弥漫深黑色。
血液涂片经染色反应后，在油浸镜下，连续观察100个成熟中性粒细胞，记录阳性反应细胞所占百分率即为阳性率；并对所有阳性反应细胞逐个按其反应强度作1＋～4＋的分级，将各级所占百分率乘以级数，相加即为积分值。通常成人NAP阳性率10～40％；积分值40～80分。注意不同的观察者的记分标准有所不同，结果易受主观因素影响，因此参考值变化较大。NAP积分明显增高或明显减低者，临床意义较大，同时应排除生理性影响。
图11 为不同阳性反应强度的示意图

图11 中性粒细胞碱性磷酸酶染色：1.中性粒细胞胞浆呈弥漫浅灰色（+）， 2.胞浆中有稍致密的棕黑色片状沉淀（2+）， 3.胞浆中充满棕黑色颗粒（3+）， 4.胞浆中充满棕黑色颗粒，并有一部分遮盖了细胞核，（4+） 5.淋巴细胞。
【临床意义】
1． 生理性变化
（1） 年龄变化：新生儿NAP活性增加，以后下降。儿童各年龄段相似，成人较儿童活性减低，老年期更低。
（2） 应激状态：紧张、恐怖、激烈运动等NAP活性可增加。
（3） 月经周期中的变化：经前期增高，行经后减低，经后期恢复。
（4） 妊娠期的变化：妊娠2～3个月的NAP积分值轻度增高，以后逐月高，分娩时达高峰，产后恢复正常。
2． 病理性变化
（1） NAP积分增加：见于细菌感染、再生障碍性贫血、某些骨髓增殖性疾病（如慢性中性粒细胞白血病、骨髓纤维化、真性红细胞增多症、原发性血小板增多症），慢性粒细胞白血病之加速期及急变期，急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、恶性淋巴瘤、骨髓转移瘤、肾上腺糖皮质激素、ACTH治疗后等。
（2） NAP积分下降：慢性粒细胞白血病慢性期，阵发性睡眠性血红蛋白尿、骨髓增生异常综合征、恶性组织细胞病等。
3． 疾病的鉴别
（1） 类白血病反应与慢性粒细胞白血病：前者明显增加，后者明显下降且积分常为零。
（2） 慢性粒细胞白血病慢性期与慢性中性粒细胞白血病：前者明显下降且常为零，后者明显增加（常在300分以上）。
（3） 细菌感染与病毒感染：前者明显增加，后者在正常范围或略降低。
（4） 再生障碍性贫血与阵发性睡眠性血红蛋白尿：前者常增加，后者常下降。
（5） 急性白血病类型鉴别：急性粒细胞白血病常下降，急性淋巴细胞白血病常增加，急性单核细胞白血病一般正常或减低。
（6） 恶性组织细胞病与反应性组织细胞增多症：前者常下降，后者无明显变化。
（7） 真性红细胞增多症与继发性红细胞增多症：前者常增加，后者无明显变化。
（8） 原发性血小板增多症与继发性血小板增多症：前者常增加，后者无明显变化。 返回
六、酸性磷酸酶（Acid phosphatase ACP）和抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate-resistant acid phosphatase TRAP）染色
【原理】酸性磷酸酶与细胞的许多生理功能和病理变化有关。用聚丙酰胺凝胶电泳发现，血细胞的ACP由7种同功酶组成(ACP 0,1,2,3,3b,4,5)。同功酶0存在高雪细胞、单核细胞和巨噬细胞；1、2、4中性粒细胞；1、4单核细胞；3b各型AL的原始细胞内；3淋巴细胞；5 毛细胞，具有独特的抗酒石酸的功能，是HCL所特有的；也有提示高雪、巨噬细胞也有。在某些血液病时，同功酶的出现与疾病特点和占优势的细胞类型有关。酸性磷酸酶染色法有硫化铅法和偶氮偶联法。硫化铅法的染色原理为血细胞内的酸性磷酸酶在酸性条件下（PH5.0）将基质液中的ß－甘油磷酸钠水解，产生磷酸根，磷酸根与硝酸铅作用生成磷酸铅，定位于胞浆中的磷酸铅再与硫化铵反应生成棕黑色硫化铅沉淀。偶氮偶联法的染色原理为血细胞内的酸性磷酸酶能使底物磷酸AS-BI萘酚水解，释放出不溶性萘酚，后者与偶氮染料坚固石榴红结合，形成紫红色颗粒沉淀于胞质内。
抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate-resistant acid phosphatase） 染色 用相同方法制备两分基质液，一分加入适量的L-酒石酸（tartaric acid），另一分不加酒石酸。取两张相同标本的涂片，分别用这两种不同的基质液作酸性磷酸酶染色。如果血细胞内的酸性磷酸酶耐酒石酸，两张均呈阳性；如不耐酒石酸，则不加L-酒石酸者呈阳性，加L-酒石酸者呈阴性反应。
【染色结果及正常血细胞反应】硫化铅法的阳性反应为棕黑色硫化铅沉淀，偶氮偶联法阳性反应为紫红色颗粒。粒细胞、单核细胞、淋巴细胞、巨核细胞、血小板、浆细胞、巨嗜细胞呈阳性（图12）。
【临床意义】
1. 帮助诊断多毛细胞白血病（hairy cell leukemia HCL）：多毛细胞白血病时多毛细胞ACP呈阳性或强阳性反应，且其活性不被L-酒石酸抑制，有助于本病的诊断（图13，14）。
2. 帮助鉴别T和B淋巴细胞：在人体发育中，T淋巴细胞的酸性磷酸酶出现在发育早期胸腺细胞阶段，并持续到成熟。定位于Goigi器中，所以大多数急性和慢性T淋巴细胞增生疾病都表现ACP活性，阳性物多呈颗粒型，也可以为阴性，以T-ALL的反应最强，B淋巴细胞增生的ACP反应弱阳性或阴性.
3. 高雪细胞和尼曼-匹克细胞的鉴别：高雪细胞ACP呈强阳性反应；并具有抗酒石酸功能。尼曼-匹克细胞呈阴性或弱阳性反应。
4. 急性髓系白血病的ACP反应：原始单核和幼稚单核细胞ACP为强阳性反应；原粒细胞对ACP反应不一，早幼粒细胞和中幼粒细胞ACP较弱，异常早幼粒细胞较强。
5. 用于ALL和ANLL的鉴别：ALL阳性物多为颗粒型。ANLL呈弥散状。
6. 浆细胞ACP呈较强的阳性反应，阳性物为大粗颗粒和珠状散在分布于细胞浆内。
7. 转移瘤细胞强阳性。 返回

图12 酸性磷酸酶染色：1.巨核细胞 2.原始粒细胞 3.中性分叶核粒细胞 4.单核细胞 5.中幼红细胞 6.淋巴细胞。

图13 HCL ACP呈强阳性 图14 HCL TRAP阳性

七、骨髓铁染色（ferric stain）
【原理】正常骨髓中有一定量的铁，以含铁血黄素的形式存在于单核巨噬细胞系统细胞的胞浆中，称细胞外铁。中、晚幼红细胞胞浆中亦含有铁颗粒称细胞内铁或铁粒幼细胞。骨髓中的铁在酸性环境下与亚铁氰化钾作用，形成普鲁士蓝色的亚铁氰化铁沉淀，定位于含铁的部位。
【染色结果及正常血细胞反应】骨髓中出现蓝色颗粒为阳性。
1． 细胞外铁 观察骨髓小粒中的铁，呈弥散蓝色、颗粒状、小珠状或块状。按阳性程度分为5级（图15）。通常正常为1＋～2＋，大多为2＋。
“－”骨髓小粒上无蓝色呈现（提示骨髓储存铁缺乏）
“1＋”有少量蓝色颗粒，或偶见小珠。
“2＋”有较多的铁颗粒和铁小珠。
“3＋”有很多铁颗粒、小珠、和少数蓝黑色小块。
“4＋”有极多的铁颗粒和小珠，并有很多密集成堆的小块。
2． 细胞内铁 观察幼红细胞内的铁。正常幼红细胞（主要是晚幼红细胞）的细胞周围可以见1～5个呈蓝色细小的铁颗粒。含有铁颗粒的幼红细胞称为铁粒幼细胞。在油浸镜下，连续计数100个幼红细胞，记录铁粒阳性的幼红细胞数，即为铁粒幼细胞所占的百分率。需同时注意细胞内的铁粒数目、大小、染色深浅和排列。如含粗大深染的铁粒数目在10个以上，并环绕细胞核排列超过核周径2/3以上者，称为环状铁粒幼细胞。铁粒幼细胞所占的百分率通常为20％～90％，平均值65％（由于各实验室的试验条件不同，参考值也有差异，各实验室应建立自己的参考值）。
【临床意义】
1． 缺铁性贫血早期骨髓中的储存铁就已耗尽，细胞外铁呈“－”。铁粒幼细胞的百分率减低，<15％，甚至为“0”。经铁剂治疗后，数天内铁小粒出现在幼红细胞中，但细胞外铁需待贫血纠正一段时间后才会出现。因此，铁染色是目前诊断缺铁性及指导铁剂治疗的可靠和切合临床实用的检验方法。
2． 非缺铁性贫血如溶血性贫血、巨幼细胞贫血、再生障碍性贫血及骨髓病性贫血等，细胞外铁多增加，常>3＋～4＋。肝硬化、慢性肾炎、尿毒症、血色病等，细胞外铁明显增加而铁粒幼细胞可减少。
3． 铁粒幼细胞贫血时，因血红素（heme）合成障碍，铁利用不良，铁粒幼细胞增多，并可见到环状铁粒幼细胞，占幼红细胞的15％以上。骨髓增生异常综合征（MDS）中，难治性贫血伴环状铁粒幼细胞增多（RAS）这一类型，铁粒幼细胞也增多，环状铁粒幼细胞>15%。

铁染色“－” 铁染色“1＋

铁染色“2＋” 铁染色“3＋” 铁染色“4＋”
图15 铁染色的阳性度分级 返回
细胞化学染色小结
正常人血细胞以及白血病原始细胞的细胞化学特征
POX SBB esterases PAS ACP CE α-NAE α-NBE
原始粒细胞 －/+ －/+ －/+ －/+ _ －/+ _早幼粒细胞 +/2+ +/2+ +/2+ －/+ _ +/+ +/2+中幼粒细胞 2+ 2+ +/2+ －/+ _ 3+ + 单核细胞 －/+ －/+ －/+ 3+ 2+/3+ + 2+淋巴细胞 _ _ _ －/+ －/+ －/+ -/2+原始红细胞 _ _ _ －/+〔1〕 _ _ +/_ 巨核细胞 _ _ _ 3+ + 2+ 2+

POX SBB esterases PAS ACP CE α-NAE α-NBE
ALL － －/少数＋ － －/+〔2〕 － ＋/++典型为珠、块状 －/+〔3〕 HAL －/+ －/+ ＋可为小珠状AUL － － － － － － －M0 － － － －/+ 可为2＋，可为小珠状M1 －/+ －/+ － ＋/－ －/+ ＋ ＋/－M2a ＋ ＋ 多为－ －/+ －/ + ＋/－ －/+ M2b 2＋ 2＋ 2＋ 2＋ －/+ ＋/－ －/+M3 3＋ 3＋ 3＋ －/3＋ － ＋/－/2+细颗粒状 －/2＋M4 2+ 2+ 2+ 2+/3+NaF抑制 2＋ －/2＋ 2＋M5 －/+ ＋/－ ＋/－强于pox,SBB 3+ NaF抑制 3+ 2+ 2+M6 － － － 2＋ ＋ 2＋ －M7 －/ PPO+ － － ＋ －/+ 2＋ 2＋小巨核酶标＋MM ＋ ＋ 转移瘤 2＋ 3＋ 2＋

注释：－阴性，＋/－弱阳性，＋中等阳性，2＋中强阳性，3＋强阳性（多数细胞）
注〔1〕α-NAE在红白血病以及一些红系统成熟障碍疾病可表现为强阳性。
注〔2〕α-NAE在少数ALL的细胞浆出现点状阳性物，这类ALL倾向于T-ALL。
注〔3〕ACP在T-ALL为强阳性，在非T-ALL为弱阳性。