急性髓细胞白血病(acute myeloid leukemia，AML)是一种高度异质性的血液肿瘤，主要特征是导致骨髓中未分化，无功能的造血干细胞(hematopoietic stem cells，HSC)异常增殖，使机体正常HSC生成受抑制[1]。目前，AML的主要治疗方法为化疗和HSC移植(HSC transplantation，HSCT)。研究发现，残留白血病干细胞(leukemia stem cells，LSC)所致的高化疗耐药性，是导致AML复发的重要因素[2]。骨髓微环境(bone marrow microenvironment，BMM)是特殊的骨髓区域，可调控HSC的数量、自我更新和增殖分化等过程[3]。近年研究结果显示，缺氧BMM可促进LSC逃避化疗药物的杀伤，并产生耐药性[4]。笔者就缺氧BMM与AML关系概述、缺氧BMM在AML发病机制中的作用、AML抑制缺氧BMM治疗方面的研究现状进行阐述，旨在为探索AML的新靶向治疗途径提供理论依据。

1　缺氧BMM与AML关系概述

AML的发生、发展不仅依赖于细胞固有致癌基因的改变，也受到正常HSC和LSC所在BMM成分的影响。研究结果证实，BMM分为2个不同的HSC生态位：成骨细胞龛和血管龛[5]。成骨细胞龛主要由成骨细胞组成，破骨细胞、神经胶质施旺细胞及调节性T细胞也参与其构成。血管龛位于血窦，主要由支持HSC增殖分化的肝窦内皮细胞组成[6]。BMM处于低氧状态，低氧分压(blood partial pressure of oxygen，PO2)是BMM的维持生理状态的重要因素，低PO2被认为是HSC生态位中的生理现象[7]。Lo Celso等[8]研究发现，造血干/祖细胞在BMM中的定位并非是随机且动态的，不同造血干/祖细胞亚群根据其分化阶段定位到不同位置。Zheng等[9]体外低氧条件细胞培养实验结果显示，低氧条件可以促进HSC更新和分化，而缺氧BMM则是HSC维持稳态的生理条件。Bapat等[10]亦发现，HSC存在于血流灌注减少的缺氧BMM中，低PO2可促进HSC的静止、自我更新，以及促进其分化成红细胞、巨核细胞和粒细胞-单核细胞祖细胞等。而在AML中，LSC的恶性增殖使骨髓缺氧加剧[11]，缺氧BMM不再是HSC的正常生存环境，进而产生一个维持LSC存活和增殖的"恶性生态位"[12]，此时缺氧BMM可促进LSC逃避化疗药物的杀伤作用，并获得耐药性[13]。因此，缺氧BMM在调节HSC和LSC的细胞活动中发挥双重作用。

缺氧诱导因子(hypoxia-inducible factor，HIF)-1是机体应对缺氧BMM的主要调控因子。HIF-1是由3个对氧敏感的α亚基(HIF-1α、HIF-2α和HIF-3α)和1个稳定的β亚基(HIF-1β)组成的异源二聚体，定位于人14号染色体，其生物学活性由HIF-1α决定[14]。HIF-1α受到PO2的精准调控，HIF-1β为细胞内组成性表达。常氧环境下，脯氨酸羟化酶活性增强，使HIF-1α发生羟基化，而在细胞质内，羟基化的HIF-1α通过泛素-蛋白酶体途径迅速降解[15]。缺氧环境下，HIF-1α在正常组织和癌细胞中都是重要的调节因子，当氧浓度低于5%时，脯氨酸羟化酶被抑制，HIF-1α不能被羟基化降解，导致HIF-1α富集，随之HIF-1α与HIF-1β结合，形成异源二聚体，调控下游基因的转录与表达[14,15]。研究发现，正常HSC优先定位于缺氧BMM，并表现出HIF-1α的富集[15]。HIF-1α基因缺失可导致HSC的静止和增殖降低。Wang等[16]采用流式细胞术对AML患者LSC中CD34+CD38-、CD34+CD38+、CD34-CD38-和CD34-CD38+ AML细胞亚群进行分类，以分析HIF-1α及靶基因GLUT1表达的结果显示，CD34+CD38-AML细胞亚群HIF-1α转录水平最高。HIF-1α通过阻断Hes1基因与启动子N-box结合，阻断Hes1基因自我调节，使Notch信号通路中的Hes1表达持续上调，维持LSC的自我更新。在AML移植小鼠模型中，沉默HIF-1α和使用HIF-1α抑制剂棘霉素(echinomyci)，可诱导LSC凋亡，使移植小鼠LSC生长能力受损[16]。Wang等[17]最新研究发现，HIF-1α靶基因同样在TP53突变型和野生型AML细胞中富集，棘霉素与靶基因的启动子区域结合，抑制HIF-1α活性，杀伤TP53突变的HSC，并直接杀伤AML LSC亚群。Deeb等[18]通过对84例年龄>18岁(中位年龄为66.3岁)的正常核型AML(normal karyotypic AML，NK-AML)患者的原代细胞进行免疫组织化学检测发现，30%(37/84)NK-AML细胞表达HIF-1α，高表达HIF-1α与患者较短的总体生存(overall survival，OS)和无事件生存(event-free survival，EFS)期相关(OS期：9.9个月比6.7个月，HR=0.586，95%CI：0.325~1.058，P=0.076 3;EFS期：9.2个月比5.4个月，HR=0.545，95%CI：0.301~0.988，P=0.045 3)。TSGA10基因位于染色体区域2q11.2，该基因的蛋白产物分子量为82 kDa，可以在细胞质中分解成27 kDa和55 kDa片段，并与HIF-1α相互作用，因此TSGA10基因表达可影响HIF-1α转录活性。对新诊断AML患者及健康个体外周血提取的总RNA进行实时荧光定量PCR分析的研究结果显示，外周血HIF-1α水平可作为AML髓外浸润和疾病进展的早期指标物[19]。因此，抑制HIF-1α及其下游因子表达可能成为AML患者的新治疗方法。

2　缺氧BMM在AML发病机制中的作用

缺氧BMM可通过HIF-1α在AML发病机制中发挥作用。HIF-1α下游基因众多，而这些下游基因的表达与能量代谢(糖酵解、柠檬酸循环和氧化磷酸化)，血管生成，细胞存活和增殖，细胞分化和迁移，自噬，蛋白水解和pH调节等细胞功能有关[3]。目前研究认为，与AML发病机制相关的HIF-1α下游基因产生的作用包括调节能量代谢、调控造血功能、促进血管生成、调控细胞增殖分化和存活、加速细胞归巢。

2.1　调节能量代谢

缺氧BMM和HIF家族蛋白可以使LSC的能量代谢方式从线粒体氧化磷酸化(oxidative phosphorylation，OXPHOS)转化为糖酵解，使乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)水平升高，从而发挥调节细胞能量代谢作用，避免在低氧环境下产生与OXPHOS功能相关的氧化应激反应[20]。Goto等[21]研究结果显示，急性单核细胞白血病THP-1细胞系可迅速适应缺氧培养条件，通过上调丙酮酸脱氢酶激酶(pyruvate dehydrogenase kinase，PDK)-1的活性，使能量代谢从OXPHOS转变为糖酵解，避免活性氧的产生。Chen等[22]比较400例AML患者与446例健康个体原代细胞代谢组学特征的临床研究发现，缺氧条件下，乳酸、2-酮戊二酸、丙酮酸、柠檬酸、2-羟基戊二酸和3-磷酸甘油水平发生显著变化，除柠檬酸外，上述代谢物的水平与AML患者的OS和EFS期呈负相关关系(OR=-0.67、-0.51、-0.48、-0.11、-0.07)。总之，缺氧BMM可导致能量代谢转化，使AML细胞对缺氧环境耐受。

2.2　调控造血功能

缺氧反应元件(hypoxia response element)是促红细胞生成素(erythropoietin，EPO)编码区下游转录增强子3′端的特异性DNA序列，HIF-1α与其结合介导EPO基因的转录[23]。HIF-1α通过上调EPO和铁代谢相关基因(例如转铁蛋白基因等)，促进生成红细胞所需的相关物质增多，使红细胞生成增加，红细胞携氧量能力增强，氧转运增加[24]。研究发现，促血小板生成素(thrombopoietin，TPO)能刺激血管内皮生长因子(vascular endothlial growth factor，VEGF)生成，促进VEGF在HSC内扩增，影响HSC的生理功能[25]。TPO促进VEGF的表达，依赖于VEGF上游靶点HIF-1α的活性及功能[25]。TPO可以通过诱导HIF-1α，增强HSC中VEGF的表达。

2.3　促进血管生成

研究发现，缺氧BMM/HIF-1α的应答可以增加VEGF表达和促进血管生成。VEGF激活血管内皮细胞受体，促进LSC的增殖[26]。HIF-1α通过促进VEGF、白细胞介素-8与骨桥蛋白的表达，促进血管生成[27]。Padró等[28]和Hussong等[29]分别进行的2项研究发现，AML患者BMM中微血管密度(microvessel density，MVD)增加，而HIF-1α和HIF-2α与VEGF表达及血管生成具有重要联系。LSC可表达VEGF受体(VEGF receptor，VEGFR)，并通过自分泌促进细胞增殖。AML患者接受异基因HSCT(allogeneic HSCT，allo-HSCT)后发生的移植物抗宿主病(graft versus host reaction，GVHD)与BMM中VEGF的表达和血管生成有关。Medinger等[30]对26例接受allo-HSCT的AML患者进行免疫组织化学检测结果显示，患者诊断时的MVD-血管内皮-钙黏蛋白水平显著高于健康对照个体(n=20)(P=0.001)，并且在诱导化疗后下降至正常参考值范围;发生急性GVHD(acute GVHD，aGVHD)患者(n=26)的BMM MVD显著高于未发生aGVHD者(n=20)(P=0.001)。

2.4　调控细胞增殖、分化与存活

HIF-1α表达促进多种生长因子的生成。转化生长因子(transforming growth factor，TGF)-α，胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor，IGF)2、成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor，FGF)与HIF-1α下游受体结合，通过PI3K/Akt/mTOR、JAK/STAT信号通路促进细胞增殖。HIF-1α表达水平上调后，HIF-1α与EPO的低氧结合区域结合，激活EPO表达，使红细胞生成增加，调控红系干/祖细胞分化，也促进血液向组织转运O2。此外，HIF-1α通过自分泌活动因子(autocrine motility factor，AMF)，调控红系干/祖细胞的迁移[31]。HIF-1α通过自分泌信号转导途径促进自身生成，促进AML肿瘤细胞发生、发展[32]。

2.5　加速细胞归巢

趋化因子受体(chemokine receptor，CXCR)4是一种7次跨膜G蛋白偶联趋化因子受体[33]，趋化因子C-X-C基序配体(chemokine C-X-C motif ligand，CXCL)12又称为基质细衍生因子-1，对HSC及LSC的归巢起到促进作用[34]。细胞归巢是血液中的细胞选择性穿透毛细血管后，经高内皮细胞微静脉(high endothelial venule ，HEV)定向迁移进入肿瘤组织的过程[35]。HIF-1α被证明可调节CXCR4和CXCL12，促进BMM中HSC和LSC归巢。CXCR4和CXCL12可构成了1个与细胞信息表达传递、迁移相关的偶联分子对，并通过PI3K信号通路增强表达。CXCR4过度表达可增强HSC的化疗耐药性，其与FMS样酪氨酸激酶(FMS-like tyrosine kinase，FLT)3突变的AML患者的预后不良相关[36]。HIF-1α诱导CXCL12表达增加，CXCL12的表达和缺氧在BMM内同时存在，缺氧可能是细胞运输和功能实现的基本条件之一。研究发现，血管内皮细胞的缺氧程度与CXCL12表达水平呈正相关关系，而通过调节氧浓度，可以实现HIF-1α对CXCL12表达的调控[37]。因此，HIF-1α可能直接对CXCL12表达进行调控，加速HSC和LSC的迁移和归巢。

3　抑制缺氧BMM治疗AML

缺氧BMM在AML发生、发展中发挥重要作用，HIF-1α及其下游靶点对AML的临床疾病特征存在潜在影响。HIF蛋白及一些下游靶点影响AML患者的预后，HIF-1α为AML发生、发展的调节因子之一。初步研究结果显示，HIF-1α的高表达与AML患者的预后不良相关[18]。缺氧BMM和HIF-1α可以使LDH水平升高，而Geva等[38]报道，移植前LDH水平可以作为评估AML患者接受allo-HSCT治疗的风险因素，并且高水平LDH与患者不良预后相关(HR=1.34，95%CI：1.06~1.70)。缺氧可降低HSC的增殖活性，使细胞周期阻滞于G0期，而LSC静止状态可能影响其对化疗药物的敏感性。Drolle等[39]发现，在缺氧环境下培养AML细胞系，对阿糖胞苷的药物效应较常氧环境显著降低，这与AML细胞在缺氧环境下凋亡抑制蛋白表达水平增加、促存活PI3K信号通路激活相关，而AML中LSC优先定位于缺氧BMM，受到缺氧引起的凋亡抑制蛋白的保护。因此，抑制缺氧BMM可能是AML的治疗方式之一，目前多项研究已在评估抑制缺氧BMM在AML中的治疗潜力。现处于研究中的抑制缺氧BMM的AML治疗药物主要为2种形式，一种是作用于缺氧激活前体药物(hypoxia-activated prodrug，HAP)，另一种是侧重于针对缺氧LSC生存所需HIF-1α及其下游基因的分子靶向药物。

3.1　HAP

HAP通过还原酶激活，作用于"氧气传感器"分子。HAP在缺氧BMM内被还原酶激活，转化成具有细胞毒性的产物。HAP针对低氧BMM的AML细胞进行杀伤，对于常氧区域细胞无药物毒性，是一种高选择性靶向药物。TH-302是一种2-硝基咪唑类HAP，在肿瘤低氧区被活化，转变为具烷化剂活性的二溴异磷酸氨氮芥。Portwood等[40]研究结果显示，TH-302通过下调HIF-1α表达水平，增加DNA双链断裂，抑制LSC增殖;在AML移植小鼠模型中，TH-302可阻滞AML小鼠的疾病进展，明显延长其OS期。Benito等[41]研究发现，在FLT3/ITD基因突变AML小鼠模型中，联合应用TH-302和酪氨酸激酶抑制剂索拉非尼(sorafenib)，不仅能诱导LSC发生细胞周期阻滞，还能通过线粒体凋亡途径诱导LSC发生细胞凋亡，从而延长AML小鼠生存期;对于化疗后残留LSC的小鼠，TH-302联合索拉非尼仍可延长小鼠生存期，这表明TH-302可能适用于消除化疗耐药性LSC。目前，TH-302治疗难治/复发性AML，已进入了Ⅰ期临床试验阶段(NCT01149915)。

IACS-010759是一种临床级线粒体电子传递链复合物Ⅰ的小分子抑制剂，对OXPHOS有高效抑制作用。临床前研究显示，IACS-010759强效抑制LSC的增殖，并诱导细胞凋亡，这可能是能量消耗和天冬氨酸产生减少的联合作用，导致核苷酸生物合成受损，有效抑制AML移植小鼠的AML细胞增殖[42]。目前，IACS-010759治疗复发/难治性AML和实体瘤的Ⅰ期临床试验正在进行中(NCT02882321)。

3.2　分子靶向药物

分子靶向LSC在有效治疗AML方面具有潜力。Wang等[16]进行的体外实验发现，HIF-1α抑制剂棘霉素有效抑制CSC集落形成单位的活性。在AML移植小鼠模型中，棘霉素通过抑制Notch信号通路中的负反馈环，优先消除LSC，有效根除LSC[16]。在复发性AML移植小鼠模型中，棘霉素能选择性杀伤白血病起始细胞(leukemia-initiating cell，LIC)，而不影响正常干细胞，3/5模型小鼠获得长期完全缓解[43]。最新研究发现，棘霉素对CD34+CD38-AML细胞亚群的抑制率达54.57%[17]。咖啡酸苯乙酯(caffeic acid phenethyl ester，CAPE)可增强HIF-1α信号通路。HIF-1α直接抑制剂PX-478，则可阻断CAPE对HIF-1α信号通路的增强作用，发挥抗AML活性[44]。IMC-1C11是一种VEGFR-2的特异性抑制剂，有效抑制LSC的体外存活，阻断VEGF介导的LSC增殖和VEGF诱导的LSC迁移。

BL-8040是一种高亲和力的合成肽CXCR4拮抗剂。BL-8040在体内、外诱导AML细胞凋亡，这种凋亡是由微小RNA(micro RNA，miR)-15a/miR-16-1表达上调介导，导致靶基因B淋巴细胞瘤/白血病(B-cell lymphoma/leukemia，BCL)-2，髓样细胞白血病(myeloid cell leukemia，MCL)-1和cyclin-D1基因表达下调。miR-15a/miR-16-1持续过表达是BL-8040诱导AML细胞凋亡的作用机制之一[45]。研究发现，BL-8040与BCL-2抑制剂或FLT3抑制剂联合治疗AML，存在协同作用，可延长AML小鼠的生存期，减少体内微小残留病灶[45]。Borthakur等[46]一项针对42例复发/难治性AML患者的Ⅱa期临床试验中，对其使用BL-8040联合大剂量阿糖胞苷治疗，患者耐受性良好，完全缓解率为29%(12/42)，中位OS期为8.4个月，这表明CXCR4靶向抑制剂BL-8040对复发/难治性AML患者具有临床疗效。

4　结语

综上所述，缺氧BMM、HIF-1α通过调节能量代谢、影响造血功能、促进血管生成、调控细胞增殖分化、加速细胞归巢等途径促进AML的发生、发展。高表达HIF-1α与AML患者预后较差相关。缺氧BMM、HIF-1α在AML耐药、复发中的确切作用机制尚不清楚，有待进一步研究。而在不影响正常HSC生成的情况下，通过抑制缺氧BMM抑制AML中LSC的增殖、分化，并进一步研究缺氧BMM、HIF-1α对LSC及HSC的作用机制，可为AML提供新靶向治疗途径。